基因工程知识要点说明

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1、. . . . . 第一章 1. 基因工程 : 是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体（供体）的基因或基 因组提取出来， 或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组， 转移到另一种生物体（受体）的细胞，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。 2. 基因工程的基本过程为哪些？切接转增检 获得目的基因：从供体细胞分离出基因组DNA ，用切酶将外源DNA切开。切（同时 选择运载目的基因的载体）目的基因与载体DNA拼接：用DNA连接酶将含有外源基因的 DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子。接 重组体分子导入受体细胞：借 助于细胞转化手段将DNA重组分

2、子导入受体细胞中。转 短时间培养转化细胞， 以扩增 DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。 增筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。 检 3. 哪些基因是真核生物特有的？ 假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的 失活基因。 基因家族：由功能相关的基因成套组合形成重复序列 哪些是原核生物特有的：插入序列。哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因 第二章 1.寄主细胞控制的限制与修饰 宿主控制限制核酸限制性切酶 宿主控制修饰修饰的甲基转移酶 以 (k) 噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。 （简述寄

3、主控制的限制与修饰现象。 ?大多数细菌的噬菌体侵染都存在着一些功能性障碍。所谓的寄主控制的限制与修饰 现象简称（ R/M体系） 。R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的 R/M体系的作用： ?保护自身的DNA不受限制； ?破坏外源DNA使之迅速降解； 2. 简述型、型和型核酸切酶的基本特性。 （1）型酶基本特性 一种是修饰的甲基转移酶 修饰 另一种是核酸内切限制酶 限制 . . . . . 有切酶活性和甲基化酶活性互斥需要 ATP 、 SAM （S腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅 助因子； EcoB 和 EcoK 是由三种不同亚基组成。多肽链：特异性亚基，识别DNA序列 的活性。多肽链：修饰亚基

4、，具有甲基化酶活性。多肽链：限制亚基：具有核酸切酶活 性有特定的识别位点切割方式： 结合在识别位点，以滚环形式沿着DNA分子转位， 从 距识别位点5 一侧几千bp 处随机切割分子，无特异性。 （2）型酶： 有切酶活性和甲基化酶活性分开反应能识别专一的核苷酸序列，并 在固定位置上切割识别序列的核苷酸对顺序呈回文结构（那项具有回文结构：识别位点的 DNA序列呈双重旋转对称）切割可形成两种核苷酸切割末端粘性末端和平末端。 粘性末端定义：指 DNA分子在限制酶作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，能 通过互补碱基间配对而重新环化起来。 （3）型酶： 由两个亚基组成的蛋白质复合物，即同时具有切酶活

5、性和甲基化酶活性 需 Mg 2+、ATP 、SAM辅助因子可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3端 24 26bp 处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的 4. 同尾酶 ： 指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸切酶。利用同尾酶 可使切割位点的选择余地更大。 同裂酶： 指来源不同但识别相同靶序列的核酸切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末 端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 星号活性： 同一限制酶当某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，即酶切位点专一性改变 的活性。包装上标“”注明。 5.DNA缺口平移、取代反应的概念 DNA缺口平移： 在 DNA分子的单链缺口上，DN

6、A聚合酶的5 3 核酸外切酶活性和聚 合作用可以同时发生。 （概念：当外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口 的 3一侧补上一个新的核苷酸，但 Pol 不能在 3-OH和 5-P 之间形成一个键， 随着 5 一侧的核苷酸不断移去， 3 一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向 移动。 ） 用途：通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。 取代反应： 如果在反应混合物中仅存在一种dNTP ，则此酶的3 5 的外切酶活性将从 ds DNA 的 3端降解，直到互补于该dNTP的碱基出现为止，然后在该位置发生合成和取代 反应。 6.

7、 各 DNA聚合酶的基本特性及其区别； （1）大肠杆菌DNA聚合酶（ Pol ）的酶活性 5 3 的聚合酶活性：需Mg2+ 5 3 的外切酶活性：可以从游离的5-OH末端水解DNA分子 ( 修复作用 ) 3 5 的外切酶活性（较低）：从 DNA链的 3-OH末端向 5水解 DNA(校对作用 ) 用途： 主要功能参与DNA的合成，起到修复作用；Pol 同 DNA分子克隆的关系最为密切。 （2）Pol 的 Klenow 片断 5 3的聚合酶活性； 3 5 的外切酶活性 无 5 3 外切酶活性。 Klenow 片断的主要用途： 修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端； 标记 DNA片断的末端；

8、cDNA克隆中的第二条链c DNA的合成； DNA序列的测定。 （3）Pol （参与DNA修复过程） 酶活性： 5 3的聚合酶活性：要求模板是双链DNA ，中间有空隙的单链DNA部分， 且空隙部分不长于100 bp； 具有 3 5 的外切酶活性，无5 3 外切酶活性； . . . . . 主要在 DNA的损伤修复中有一定的作用 （4）Pol 聚合作用： 是细胞 DNA复制所必需的； 3 5 的外切酶活性， 底物是单链DNA ； 5 3 外切酶活性，底物是单链DNA 。 （5）T4 DNA聚合酶 5 3的聚合酶活性； 3 5 的外切酶活性； 无 5 3 外切酶活性； 取代反应 : 在只有一种dN

9、TP时，外切至互补核苷酸暴露时停止； （6）T7 DNA聚合酶 5 3的聚合酶活性； 3 5 的外切酶活性（是klenow 片段的 1000 倍） ； 无 5 3 外切酶活性； （7）耐热 DNA聚合酶（ Taq DNA聚合酶）（选择题） 具耐高温的特性，最适活性温度为72，连续保温30min 仍有活性，一次加酶即可满 足 PCR反应全过程的需求； Mg 2+ 依赖酶；具有聚合酶活性；具有53 外切 酶活性，无35 外切酶活性 SDS完全抑制其酶活性。 （8）反转录酶 依赖 RNA的 DNA的聚合酶。 多肽链具有反转录酶活性和RNase H 活性； 多肽链具有以RNA-DNA 杂交分子为底物的

10、5 3脱氧核酸外切酶活性。 以 mRNA 为模板合成cDNA ；在反转录酶作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二 条 cDNA 。 7. 连接酶所需的条件供能分子、磷酸基团和羟基。 概念： 能够催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。即能够将DNA链上彼此相邻的3 - 羟基（ OH ）和 5- 磷酸基团（ -P） ，在供能分子的作用下，形成磷酸二酯键。 需要三种成分参与： 3 -OH，5 -P，提供能量的分子 供能分子 ：NAD+ （烟酰胺腺嘌呤二核酸）在E.coli等细菌中选用 ATP （腺苷三磷酸）动物细胞、噬菌体中选用 注：只能连接缺口（nick ） ；不能连接裂口（gap）

11、 ； 而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。 8. 缺口： 在双链 DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去磷酸二酯键所出现的单链断裂。 裂口 ：在双链 DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。 9、碱性磷酸酶： 将 DNA末端的 5端磷酸基除去， 使其 5端变成 3 羟基， 能防止自身环化。 作用： （1） 去除 DNA 和 RNA 的 5” - 磷酸基，然后在 T4多聚核苷酸激酶催化下，用 32PATP 进行末端标记，继而进行序列分析。（2）去除载体DNA5 ” - 磷酸基，防止自身环化，降低 本底，提高重组DNA检出率。 发夹结构： 10、末端转移酶特性：

12、催花 dNTP添加到 3-OH端，且不需模板； 需 Co 2+。 用途 ： 给载体或cDNA加上互补的同聚尾；标记 3末端。 第三章 1、基因载体：离开染色体的外源DNA不能复制，而插入的外源DNA可作为复制子的一部分 在受体细胞中进行复制，这种复制子就是外源基因的载体。 2、报告基因：有特殊意义的基因，重组子转入宿主细胞中，可依据报告基因从其他细胞中 识别区分甚至挑选出来。 2、载体应具备的特性： 能在宿主细胞进行独立和稳定的DNA自我复制，插入外源基因后，仍保持稳定的复制状 . . . . . 态；易于从宿主细胞中分离，并行纯化；载体 DNA序列中有单一的酶切位点，并位于 DNA复制的非必

13、需区； 具有能够观察的表型特征，如报告基因 （遗传标记），插入外源DNA 后，这些特征可以作为重组DNA选择标志。 3、载体的致死效应：利用载体进行克隆时，有时可能对大量的克隆化基因和克隆化基因产 物可能有害，宿主细胞呈现致死效应。如大量表达目的蛋白不利于宿主繁殖，使其致死。 3、R1质粒和 Col E1-K30质粒 R1质粒Col E1-K30 E.Coli中严紧型松弛型 奇异变形杆菌中松弛型严紧型 4、质粒构型：常见的构型: SC L OC A. 共价闭合环形DNA(cccDNA):呈现超螺旋的SC构型 B. 开环 DNA(ocDNA):即 OC型。 C. 线性 DNA(lDNA):即 L

14、 型。 根据寄主细胞所含的拷贝数多少质粒分为严紧型和松弛型。 5、质粒的种类 F质粒：又叫F 因子、性质粒或致育质粒。是最具代表性的单拷贝的接合型质粒，共编码着 19 个转移基因。 R质粒：又称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因。 Col 质粒：产生大肠杆菌素因子，编码有控制大肠杆菌素合成的基因。属非结合质粒。 6、Col E1 质粒的迁移作用：由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移的过程。 其中参与迁移的有两种基因： bom 基因：位于Col E1DNA 上的特异位点 mob 基因： Col E1 质粒特有的，其编码的核酸酶作用于bom位点 7、细菌质粒的不相容性 在同一个大

15、肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的质粒。也称为质粒的不亲和性。 是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系 中稳定地共存的现象。 8、质粒的报告基因应用类型：插入失活效应；互补 简述如何应用插入失活和-互补（蓝白筛选）来筛选重组子 pBR322质粒载体有 :抗氨苄青霉素基因(ampr); 抗四环素基因 (tetr) 互补： LacZ（半乳糖苷酶基因）有两个主要的亚基，亚基和 亚基， 与 相结合就能表现出半乳糖苷酶活性，能将无色底物X-Gal 变成蓝色。 片段基因coli基因组- 肽基因质粒 ?将含有 - 肽的质粒转化到coli上（- 互补） ，形成蓝色

16、菌落； ?插入外源基因，使- 肽编码区被破坏，LacZ 失活则形成白色菌落。 利用 - 互补（蓝白斑筛选）进行重组子的筛选。 9、如何对质粒进行人工改造，使其成为载体。 （1）减小分子量：可容纳外源DNA更长； （2）改造切酶位点，具有若干限制酶切单一位点的多克隆位点（人工合成且密集排列）； （3）插入外源基因后，较易导入宿主菌复制和表达，且不会因接触而转移到另一个细菌； （4）具有一个或几个报告基因。 克隆载体：复始起始点、遗传标记、多克隆位点 10、 pBR322和 pUC质粒的各组成部分的来源分别是什么？ （1）pBR322主要组成部分的来源 亲本： pMB1和 pSF2124 ; ampr 基因来源于pSF2124； . . . . . tetr基因来源于Psc101; 复制起点（ ori ）Col E1 11、穿梭质粒 ：是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种