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1、第八章 原位杂交组织化学,原位杂交组织化学（ISHH） 原理： 用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸 序列的方法。 特点：杂交在载玻片上的细胞进行。 分类： 根据所用探针和靶核苷酸不同- DNA-DNA杂交、 DNA-RNA杂交、 RNA-RNA杂交 根据探针标记物是否直接被检测 直接法、间接法,一 原位杂交的由来与发展（一）核酸分子杂交技术,按其作用方式大致分为液相杂交和固相杂交两种 液相杂交：参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 液相分子杂交技术包括： 吸附杂交 发光液相杂交 液相夹心杂交 复性速率液相分子杂交,固相杂交： 是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上
2、常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 固相杂交技术包括： 菌落原位杂交 斑点杂交法 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 组织原位杂交,（二）原位杂交技术的发展,在近20年飞跃发展的突出特点： 由分子遗传学研究提供的探针大量增加； 探针生产的可靠性和速率大大发展了； 非放射性标记物的发展使原位杂交技术成为实验室的常规技术和临床日常应用的诊断技术。 新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。,二 原位杂交组织化学基本技术,原位杂交的基本方法和应用原则： 杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减
3、低背景染色等； 杂交； 杂交后处理； 显示（visualization）： 放射性自显影显色、非放射性标记显色,（一）原位杂交的基本要求,1 固定 2 玻片和组织切片的处理 3 杂交 4 杂交后处理 5 显示 6 对照实验和ISHH结果的判断,1 固定 固定剂的应用和选择原则： 保持细胞结构； 最大限度地保持细胞内DNA或RNA水平； 使探针易于进入细胞或组织。,DNA：比较稳定，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。 RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解减少到最低限度，固定剂的种类、浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。,固定剂： 多聚甲醛
4、、醋酸-酒精混合液、Bouins固定剂、 Carnoys液,优缺点： 沉淀性固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouins液、 Carnoys液 能增加核酸探针的穿透性，但不能最大限度地保存RNA， 且对组织结构有损伤。 戊二醛：能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质 产生广泛的交叉连接，从而影响了核酸探针的穿透性。 多聚甲醛：仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。,多聚甲醛mRNA的定位 将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中12h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛
5、约10min，空气干燥后保存在-70。如冰箱温度恒定，在-70可保存数月之久不会影响杂交结果。,病理学活检取材 福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号。 石蜡包埋切片 由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片，同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。 冷冻切片 应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。,2 玻片和组织切片的处理,（1）玻片的处理 热肥皂刷洗 自来水清洗 清洁液中浸泡24h 清水洗净 烘干 95%酒精中浸泡24h 蒸馏水冲洗 烘干 烘箱温度150过夜以去除RNA酶 盖玻片硅化处理 锡箔纸包裹无尘
6、存放,（2）增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 根据应用固定剂种类、组织种类、切片厚度和核酸探针长度而定。 常用方法： 稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂 Triton X-100、酒精或某些消化酶等。 优点: 通过去蛋白作用增强组织通透性和探针的穿透性,提高杂交信号. 缺点: 减低RNA的保存,影响组织结构形态.因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。,（3）减低背景染色,预杂交（Prehybridization）: 是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。 杂交后洗涤: 采用低浓度的
7、RNA酶溶液（20g/ml）洗涤一次，去除残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。,（4）防止RNA酶的污染 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤消除RNA酶,亦可用消毒锅。 要破坏RNA酶，最低温度必须在150左右。 消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出 时空气污染。 杂交前及杂交时所用的溶液需经高压消毒处理。,3 杂交（Hybridisation）,杂交:核酸探针进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。 是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。,杂交方式:是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。 加盖片的目的 防止孵育过程中
8、的高温（50左右）导致杂交液的蒸发; 硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑,无气泡,不会影响 组织切片与杂交液的接触; 盖玻片自身重量能与杂交液吸附达到覆盖和防蒸发的作用。,杂交注意环节 （1）探针的浓度 原则:探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。最佳原 则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合 度为目的。,杂交液的量要适当: 以1020l/每张切片为宜。 杂交液过多浪费，且液量过多常易致盖玻片滑动脱落,过量 的杂交液含核酸探针浓度过高，易导致高背景染色等后果。,（2）探针的长度 最佳长度应在50100个碱基之间。 探针短- 易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 500个碱基的探
9、针- 杂交时间约需20h左右。 200500个碱基的探针- 可应用. 超过500个碱基的探针- 在杂交前最好用碱或水解酶进 行水解，使其变成短的片段， 达到实验所需求的碱基数。,（3）杂交的温度和时间 杂交温度： DNA或RNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。原位杂交中，DNA、RNA探针需要的Tm分别是90、95，这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交液中加入盐和甲酰胺，减低Tm。根据探针的种类不同，温度略有差异。,杂交时间： 16-20h或孵育过夜,甲酰胺：在杂交液中占50%左右；调节杂交反应温度，利于保持组织形态结构；防止低温时非同源性片段结合；
10、但具有破坏氢键的不稳定作用。 硫酸葡聚糖：在核酸杂交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度；促进杂交率，特别是对双链核酸探针。,甲酰胺和硫酸葡聚糖：,（4）杂交严格度（Hybridization stringency） 杂交严格度：表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。 错配对杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，反应亦然。,低严格度：杂交及冲洗条件在Tm3540之间，高盐或低甲
11、酰胺浓度。大约有70%90%的同源性核苷酸序列被结合，可导致非特异性杂交信号的产生。 中严格度：Tm 20-30的范围。 高严格度：为 Tm10-15，低盐和高甲酰胺浓度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。,4 杂交后处理,包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。,目的：通过杂交后的洗涤将组织切片中非碱基配对除去，有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。 洗涤的条件：如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低，而温度则由低到高。,注意事项： 漂洗过程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液 漂洗也很难
12、减少非特异性结合，从而增强了背景染色。 放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法测 背景染色作为改善漂洗程序的指针。,5 显示 Visualization,又称检测系统 Detection system 根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检 测系统进行不同显色处理。 放射自显影： 图象分析仪检测银粒的数量和分布的差异。,非放射性核酸探针杂交的细胞或组织： 酶检测系统显色 显微分光光度计或图像分析仪检测。,6 对照实验和ISHH结果的判断, Northern 和 Southern印迹杂交法。 可用结合的免疫组织化学和ISHH法从蛋白质（或多肽）水 平和转录水平在相邻切片或
13、同一切片中证明同一种多肽和相 应mRNA共存于同一细胞中。, 预先将切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技术证明丢失的是DNA或RNA。事先与特异性的cRNA或cDNA进行杂交。再进行ISHH，其结果应为阴性。由于同一RNA探针和组织内 mRNA序列顺序是相同的，应用其进行ISHH，结果应为阴性。 检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的情况下进行。,多因素都将影响ISHH的实验结果。,（二）核酸探针,1 核酸探针的种类 2 探针的标记与应用,1 核酸探针的种类,（1）按标记方式分类 直接法和间接法： ）直接标记探针 应用藕联异硫氰酸荧光素（FITC）或罗丹明Rhodamin
14、e等荧光物质的dNTP或NTP直接标记探针，杂交洗涤后即可在显微镜下检测。,）间接标记探针 采用生物素或地高辛等半抗原分子作为分子标记探针，杂交洗涤后分别用抗生物素抗体和抗地高辛抗体作为配体进行检测，配体上分别连有不同的荧光物质，在荧光显微镜下观察分析。,两种方法的比较： （1）直接标记的DNA探针杂交后经过简单洗涤就可显示杂交信号，简单方便，而间接标记的探针杂交后需通过繁琐的检测步骤； （2）间接标记的探针可进行多步骤信号放大，但其受配基亲和力的影响。而直接标记的信号放大一般受到限制，目前多用Dupon公司的TSA系统进行直接标记信号的放大。 （3）对于多色FISH，往往选择直接标记法标记探
15、针。,（2）按核酸性质分类 DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针,（3）按染色体上位置分类： 重复序列探针 涂染探针 基因探针及其它,2 探针的标记与应用,切口平移法（Nick translation） 随机引物法 (Random Primer) 末端标记法 PCR标记法 体外转录标记法,不同模板需不同标记方法,生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用,1 光敏生物素标记cRNA探针的应用,2 酶促生物素标记cRNA探针的应用,1 光敏生物素标记cRNA探针的应用 光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照1020min，生物素就结合在DNA或RNA分子上，属于化学修
16、饰法，此方法简单；成本低；适用于大量制备（50ug）。,光敏生物素试剂种类： 光生物素（乙酸盐） 补骨脂素生物素。 生物素-聚乙二醇-当归素（BPA）：在长波UV下它可与DNA碱基共价键结合。BPA反应物与DNA结合比光敏生物素更特异，在可见光下它不与核酸反应，这个特异性可使BPA只标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其他细胞大分子。,光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序如下：, 石蜡切片脱蜡入水后，PBS洗；冰冻切片直接入PBS洗。 0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。 0.4%Trixtion X-100 PBS洗15min。 1ug/ml蛋白酶K，37保温30min。 4%多聚甲醛PBS固
