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1、第八章 发酵工程下游加工工程 (downstream processing) 第一节 概 述 一. 重要性 1. 产品分离纯化是最终获得商业产品的环节 2. 发酵液是复杂的多相系统 2. 生物产物的特殊特点：浓度、稳定性等,几种产品在发酵液中的浓度 产品 典型浓度（g/L） 抗生素 25 氨基酸 100 酒精 100 有机酸 100 酶 20 蛋白质 10,4. 投资费用高 抗生素、乙醇、柠檬酸占60% 纯化蛋白质8090% 5. 分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展,5. 上游要为下游创造条件 选育不产生杂质的菌种 胞内产物变为胞外产物 在细胞内形成包含体 给目的产物接上特殊“物质”,二
2、. 基本原理 根据混合物中不同组分分配率的差异将其分配于几个物相中，如溶剂提取、盐析、结晶等 或将混合物置于某一物相中（液相），使各组分分配于不同区域，如电泳、超离心、超滤等,三. 一般程序 1. 预处理和固液分离：加速固液相分离 2. 细胞破碎分离胞内产物 3. 初步纯化（提取）：除去与目的产物性 质差异很大的杂质 4. 高度纯化（精致）：除去与产物性质相 似的杂质 5. 产品加工,第二节 发酵液的预处理和固液分离 一. 预处理 分离菌体和其它悬浮颗粒 去除部分可溶性杂质 改变滤液的性质,（一）过滤特性的改变 产物浓度低110% 悬浮颗粒小 液相粘度大 性质不稳定,1. 降低液体粘度 稀释
3、升高温度 2. 调节 pH 改变某些物质电荷特性 3. 凝聚与絮凝 改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质 的分散状态,4. 加入助滤剂 不可压缩的多孔颗粒 硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠粉、白土、 炭粒、淀粉等 5. 加入反应剂 消除杂质对过滤的影响 新霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠 磷酸钙：助滤剂，使某些蛋白质凝固,（二）去除高价无机离子 1. Ca2+、Mg2+、Fe2+等影响树脂的交换容量 2. 用草酸去除钙离子，草酸钙还能促进蛋 白质凝固 3. 三聚磷酸钠与镁形成可溶性络合物 Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ 4. 黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀 3K4Fe(C
4、N)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+,（三）去除可溶性杂蛋白 1. 蛋白质等电点沉淀 两性物质，稳定性与所带电荷有关 酸性溶液中带正电荷，碱性中带负电荷 2. 酸性溶液中与阴离子物质结合形成沉淀 三氯醋酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味 酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等 3. 碱性溶液中与阳离子形成沉淀 Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等,4. 盐析 亲水胶体，加入碱金属中性盐，脱水剂 5. 热变性 一般蛋白质在7080C发生不可逆变性 如链霉素发酵液在pH3.0，加热到70 C保 持0.5h后过滤 柠檬酸发酵液在80 C处理 6. 加入絮凝剂 7. 吸附作用,（三）去除色素及
5、其它物质 1. 色素产生 微生物生长代谢产生，培养基带来 2. 去除方法 离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等吸附 如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋白质,二. 发酵液固液分离 （一）离心 （二）过滤 菌种对过滤速度影响很大 真菌容易过滤，放线菌则难 培养基组成对过滤也有影响,第三节 微生物细胞破碎 一. 微生物细胞壁的组成与结构 微生物种类，培养基组成影响细胞壁 二. 常用细胞破碎方法 1. 珠磨法（bead mill） 实验室：Mickle捣碎机、匀浆器Braun 中试：胶质膜处理 工业：高速珠磨机（High-speed bead mill）,2. 高压匀浆法（
6、High pressure homogenization） 大规模细胞破碎方法 高压匀浆器 对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多 次循环方法 丝状真菌、较小的G+菌，含有包含体（Inclusion body）的基因工程菌不宜用此 法,3. 超声波破碎（Ultrasonication） 杆菌比球菌容易破碎 G-比 G+容易破碎 酵母菌不易破碎 实验室较常用的方法，样品温度？ 4. 酶溶法（Enzymatic lysis） lysozyme protease cellulase zymolyase 价格高，通用性差，产物抑制的存在 自溶法（Autolysis）,5. 化学渗透法（chemical permeation） 改变细胞壁或细胞膜的通透性 TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂 双层 EDTA：对G-菌外膜有破坏作用 有机溶剂：分解细胞壁中的脂类 变性剂：脲、盐酸胍与水中氢键作用 优点：选择性，易于固液分离 缺点：通用性差，效率低，毒性,6. 其他方法 X-press法 渗透压法（osmotic pressure） 反复冻溶法 多种方法结合 与上游过程结合 与下游过程结合,
