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1、1,第一章 光谱分析第二节 荧光分析法,一、概述 二、分子发光的理论 三、荧光分析仪器 习题,2,第一章 光谱分析第二节 荧光分析法,一、概述 1、荧光光度分析法 由激发态能级回到基态能级的过程中以光的形式放出多余的能量，并发射出比原波长更长的光谱，这一过程称分子发光，检测分子发射光谱的分析方法称为荧光光度分析法。,第一章 光谱分析第二节 荧光分析法,一、概述 2、荧光分析特点 专一性强 灵敏度高 选择性强 发光发式多 可分析参数多,返回,3,4,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,二 、分子发光的理论,磷光,荧光,发射荧光和磷光的示意图,5,常见的光致发光现象是荧光和磷光 荧光和磷光的主要
2、区别: 荧光: 激发光停止照射后，发光过程持续 10-9-10-6s 磷光: 发光过程持续10-4-10s 荧光是从最低单线激发态发出，磷光则由最低三重态能级发出。,二、分子发光的理论,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,耗能方式 在同一能级中分子间的相互碰撞消耗能量； 无辐射衰减转给周围分子变成振动消耗； 辐射荧光以光子的形式释放能量； 光分解消耗分子内部的能量。,6,分子荧光的类型 物理发光 指荧光分子吸收了光能而产生的荧光，称为物理发光。也称光致荧光。 化学发光 是指分子与分子之间的化学反应所产生的化学能，在化学反应过程中释放能量而发射荧光。也称化学荧光。 生物发光 通过生物体内的荧光
3、酶与荧光物质相互作用，在生物化学反应过程中所释放出来的光能。也称生物荧光。,7,8,激发光谱: 固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，以激发光波长为横座标，荧光强度为纵座标作图，即可绘制。 发射光谱: 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，将荧光的光波长为横座标，荧光强度为纵座标作图便可得到荧光光谱,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,发射光源,发射光源,(改变波长),选择最大发射波长,固定波长,(改变波长),激发光谱测试示意图,发射光谱测试示意图,9,10,11,荧光量子产率 分子产生荧光必须具备两个条件： a 分子必须具有与所照
4、射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光提供辐射能； b 分子吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子的能力。产生荧光量子的强弱可以用荧光产率表示。它是荧光分子发射荧光的能为参数。（也称荧光效率或量子效率)。,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,12,荧光过程的量子效率f : 如kfkc和kx，f1。 如kc或kxkf，则f 0。 kf荧光发射的速度常数； kc和kx为其它有关速度常数的总和。,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,13,对低浓度溶液样品，保持一定最大发射波长和最大激发波长条件下测得荧光强度If可表示为： If =2.303 I0 bc I0为激发光强度；
5、b 为液池厚度； C 为浓度； 摩尔吸光系数 在一定条件下： If = K c 荧光强度与荧光物质的浓度成之正比,返回,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,14,荧光猝灭（荧光熄灭）： 广义的说，指任何可使物质荧光强度下降的作用，任何可使荧光强度不与荧光物质的浓度呈线性关系的作用，或任何可使荧光量子产率降低的作用。 狭义的说，指荧光分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。 荧光猝灭剂：与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质，称-。,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,15,三、荧光分析仪器,第一章 第二节 荧光分析法,荧光分光光度示意,紫外分光
6、光度示意,荧光分光光度计根据发射光谱的特点设计的紫外分光光度计是根据吸收光谱设计的,二者差异主要有： 测光角度不同 单色器位置不同 比色杯不同,荧光检测器与入射光源方向成90角，对面为暗背景。紫外的检测器位置与入射光源平行。,荧光计的单色器设在检测器前面，样品的发射光经单色器分光后进入检测器。紫外计单色器设在样品池前面。,荧光计使用的是四面透光的样池，紫外计使用的是两面透光的样池,16,主要技术指标：波长范围：200-850 nm； 波长精度： 1.2 nm，发射狭缝：2.5-20 nm狭缝范围：激发狭缝：2.5-15 nm；发射滤光片：290, 350, 390, 430, 530 nm（通
7、过计算机选择），样品池：1 cm 荧光池信噪比：62：1水拉曼峰测定，狭缝10 nm）,主要技术指标：波长范围：200-900 nm；波长精度： 1.0 nm；分辨率： 0.15 nm狭缝范围：0.15-20 nm信噪比：20：1（水拉曼峰测定，狭缝5 nm）发射滤光片：290, 350, 390, 430, 530 nm（通过计算机选择）样品池：1 cm 荧光池,基本功能：(1)激发光谱、发射光谱；(2) ms级发光寿命测定；(3)荧光、磷光测定；(4)液体、固体样品测定,19,激发光源 作用：提供连续辐射，激发样品 要求：光源（I0）强度足够；强度与波长无关 种类： 汞弧灯、氢灯或氙灯。
8、激发单色器- 作用：置于光源和样品之间的为激发单色器或第一单色器,筛选出特定的激发光源。,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,20,样品池 用石英制成，形状:正方形、长方形、圆形的。低温测定时在石英液槽外套一个盛放液氮的透明石英真空瓶。 发射单色器 用于选择投射到检测器的荧光波长。 检测器 荧光或磷光的强度较弱，要求检测器灵敏度高。,返回,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,四、分析方法 1、定量分析 标准曲线法 同紫外可见光度计的标准曲线法 内标法 在一定浓度范围内，选择一个标准样品浓度，测得值与同样条件下的未知样品值进行比较 未知样品浓度（mg/mL）=（A1/A2）C A1未知样品的荧光发光值 A2标准样品的荧光发光值 C标准样品浓度,21,2、定性分析 根据荧光发射的波长和出现的峰位，确定物质结构的某些特征。,22,23,作 业 1、简述影响分子发生荧光的因素 2、名词解释： 荧光猝灭 ，量子产率,返回,第一章 光谱分析 第二节 荧光分析法,
