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1、第二章 制备色谱基础,Preparative Chromatography Lujiang Yuan,制备色谱,任何一种分离方式均可用于制备目的，色谱和电泳也不例外（注意实际效果！）。 制备色谱是指采用色谱技术制备纯物质，即分离、收集一种或多种色谱纯物质。 制备色谱中的“制备”这一概念指获得足够量的单一化合物，以满足研究和其它用途。制备色谱的出现，使色谱技术与经济利益建立了联系。制备量大小和成本高低是制备色谱的两个重要指标。 气相制备色谱主要用于石油化工产品和挥发性天然产物的色谱纯样品制备。,仪器分析所需纯样品量,思考：这三个指标是相互制约达的，不同分离目的有不同要求。请具体分析： 1）分离分
2、析 2）制备分离,评价制备色谱效率的主要指标是单位时间内分离纯物质的量，以纯组分量和该组分保留时间之比表示，定义为产率。另一指标是最大允许分离样品体积，它决定于固定相的负荷和色谱柱尺寸。,Introduction,一、线性色谱 组分在固定相和流动相中的平衡浓度呈正比例关系，也即吸附分配等温线为一条直线。 分析色谱进样量小，样品在固定相流动相中的分配关系大多为直线，因此分析色谱大多为线性色谱，其色谱峰符合高斯分布。,二、非线性色谱,图 三种吸附等温线和对应的色谱峰形状,流动相,CS,Cm,Cm,Cm,CS,CS,1、色谱峰不对称,2、保留时间随样品量大小而变,3、色谱峰高度与样品量不成正比例关系
3、,此时，如果用峰高来定量是不准确的,制备色谱,二、制备分离的目标和策略,1、目标 A 样品的性质:组成，基体，理化性质，相态，浓度，价值； B 产品的纯度：要求达到的纯度，浓度很低的天然产物达70，核磁和红外95，化学分析标品95；生物制品可用活力来表示； C 制备量： D 时间 E 成本：制备分离成本很高，有时占整个成本的80,2、分离策略,A 分离因子：两组分质量分配比之比； B 柱效：N=L/H, Van Deemter 方程； C 容量因子：调整保留时间与死时间之比； D 条件优化：用液相或薄层色谱在分析型规模下优化，然后放大到制备规模；,分离因子,分离因子是两种物资质量分配比之比，一
4、般由两物资调整保留时间之比而求得，也可由两物质容量因子之比来计算。 分离因子越大，两组分峰的距离越远。当样品固定时，分离因子取决于固定相和流动相的性质。 因此，选择固定相流动相是获得大的分离因子的关键。 How?,固定相的选择,首先考虑样品的性质 疏水样品选择反相固定相 亲水样品选择正相固定相 大分子选择离子交换色谱固定相 碳水化合物选择疏水色谱固定相 无几离子选离子色谱固定相 合成聚合物选凝胶色谱固定相 立体异构样品选环糊精固定相 外消旋样品选手性固定相,更多的数据可以从色谱分析手册上查到,固定相选择的原则,相似性原则 极性化合物：极性固定液，极性小的先出峰； 非极性化合物：非极性固定液，沸
5、点低的先出峰； 非极性混合物：极性固定液，非极性先出峰； 能成氢键的样品（醇、酚、胺）：极性固定液或氢键固定液如PEG20M;,确定了固定相的类别后，还有必要对固定相的具体种类进行筛选，如常规的反相色谱固定相就多达10多种。,具体的结果只有通过实验来确证。 甚至还可以考虑使用混合固定相。 流动相的选择 选择流动相必须根据确定的固定相来决定 反相固定相：极性有机溶剂水 正相 ： 非极性溶剂极性溶剂,流动相的性质要求,流动相应不改变填料的任何性质：碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。离子交换树脂排阻色谱遇到某些有机溶剂会膨胀或收缩，从而改变柱床的性质。
6、纯度。 必须与检测器匹配。 粘度要低（应2cp）。沸点100以下最好。 对样品的溶解度要适宜。 样品易于回收。应选用挥发性溶剂。,流动相的pH值,采用反相色谱法分离弱酸（3pKa7）或弱碱（7pKa8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。 对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在； 对弱碱，情况相反。 分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol
7、/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。 注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。,洗脱能力,在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。 反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等 。 乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。价格是甲醇的67倍。,在通常情
8、况下，首先要考虑的是溶剂的极性。但是对于缺乏经验的新手不防用下面的方法来的快：,1由强到弱： 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试 验， 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。 2 三倍规则 ：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 3 粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。,如果做液相色谱分析还要注意!,水：超纯水电阻率（Mcm），25，最小
9、10.0 -18.0硅酸盐（mg/L），最大 0.05 -0.003微粒（microm）滤器 0.22 -0.2 流动相脱气过滤o.2uM或0.45uM 流动相要现配现用。 样品要过滤: 样品用流动相溶解：,柱效,样品对柱效的影响 为了最大效率地得到目标产物，制备色谱总是在过载的情况下操作，严重的过载会使N很快下降，一学者建议控制在组分峰的容量因子下降10左右。 样品的理化性质，浓度大小，分配比，扩散系数及容量因子等都有影响。,H=L/N,固定相对柱效的影响,颗粒大小，分配范围； 形状，孔径大小； 表面积或比表面积； 表面化学性质；,流动相的影响,包括流动相的化学性质； 组成； 黏度： 扩散性
10、质以及线速度；,色谱柱的影响,柱结构是否合理； 填充是否合理：有否很大的死体积，填充是否均匀，紧密度是否适中等；,容量因子,（tR-tM)/tM =tR/tM 如右可见，当容量因子达到一定值后，对分离 度的影响并不是很大。因此，在制备分离过程 中我们不是无限制地增加K值，因为K值的增加 是以时间和大量的溶剂为代价的。除非收集的 物质是很昂贵的物质。 k:1-5 比较合适； 2 分离容易； 21.5 能进行制备分离 1.51.3 分离困难 1.3 制备分离非常困难,条件优化一般步骤,选择最佳薄层色谱或HPLC分离条件,在分析的条件下进行制备分离,放大到制备规模进行制备分离,收集,分析纯度,如不和
11、要求,重新在分析设备上改进分离条件,合并相同组分,如果需要可进一步提纯产品,目标物质,制备色谱过程,制备色谱过程,第三章 制备薄层色谱,1938年，NA.lzmailov and MS.Schraiber在显微镜的玻片上涂上氧化铝分离酊剂，但没有多大进展； 1949年，JE.Meinhard and NF. Hall 用淀粉为黏合剂制成了氧化铝及硅藻土板，分离无机离子； 1956年，E.Stahl 对吸附硅胶的规格，性能，厚度进行了系统研究，于1965年出版了薄层色谱手册；,Definition of TLC,A technique that uses a sorbent applied to
12、 a planar support, called a plate, for separation. The sample is applied to the sorbent that is contained in a sealed container called a developing tank. The solvent moves up the support through capillary action and causes the analytes to migrate up the sorbent based in the differential affinity bet
13、ween the solvent and the sorbent. Standard TLC uses a sorbent that is prepared from 10- to 60-um particles that is applied to the plate in a thickness of 250um. The standard plate dimensions are in the 10cm 10cm to 20cm 20 cm range.,Interpretation,Calculating the Rf value,Calculating the Rf value,Ca
14、lculate Rf Value,Rf Value,The Rf value needs to be between 0.0 and 1.0 If the value is over 1.0 or less than 0.0, the calculation is wrong If the Rf value is greater than 0.8 or lower than 0.2 the values are hard to interpret, thus creating a larger error The best Rf values are 0.3 to 0.6,Rf Value,W
15、hat affects the Rf value? Temperature Solvent Thickness and amount of spot Other compounds,第一节 实验材料与装置,一、薄层板,10 x20cm, 50片/包,F254 10 x10cm 25片/包,F254 10 x20cm 50片/包,薄层层析的支持剂,薄层层析的支持剂较常用的是硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺及DEAE纤维素。 无机类支持剂的颗粒以150200目(直径为00701mm)、薄层厚度为0251mm较合适。有机吸附剂如纤维素等的颗粒为70140目(直径0102mm)、薄层厚度为12mm
16、最恰当。,自制薄层板,玻板：5x20， 10 x20， 20 x20， 20 x40， 20 x100cm 硅胶：表面积300500m2/g, 孔径100nm,粒度10-40um,高效薄层用510um. 商品硅胶字母的意义： H 表示不含黏合剂； F 表示含荧光物质； G 表示含锻石膏黏合剂； F254表示在紫外254nm照射下发荧光； F365表示用365nm激发； P 表示制备用硅胶；,板的大小,板宽可增加制备量； 长度不宜太长，太长展开慢，且由于扩散的原因，太长对分离没有多大改进，长度一般20厘米； 制备板的方法有干法湿法两种，但湿法用的更广泛些。,干法制板,干法制备薄板可达7mm，不需要黏合剂.制备方法也简单： 在长方形的金属或玻璃浅盘中松散地装上吸附剂就可以了，可以用玻棒或相应的工具把表面刮平。,湿法制板,湿法制板可分为平铺法涂铺法。 平铺法：待铺玻璃板两边用玻璃做边框，将调配好的吸附剂倒在玻璃板上，然后用玻璃棒刮平，去掉边框即可。 涂铺法：一般用涂铺器涂铺的方法。 常用的黏合剂：1015的锻石膏，0.2-1
