实时荧光定量PCR

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1、实时荧光定量 PCR实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 于 1996 年 由 美 国 Applied Biosystems 公 司 推 出 ， 由 于 该 技术 不 仅 实 现 了 PCR 从 定 性 到 定 量 的 飞 跃 ， 而 且 与 常 规 PCR 相 比 ， 它 具 有 特 异 性 更 强、 有 效 解 决 PCR 污 染 问 题 、 自 动 化 程 度 高 等 特 点 ， 目 前 已 得 到 广 泛 应 用 。 本 文 试 就 其定 量 原 理 、 方 法 及 参 照 问 题 作 一 介 绍 。 一 、 实 时 荧 光 定 量 PCR 原 理所 谓 实 时 荧 光 定 量 PC

2、R 技 术 ， 是 指 在 PCR 反 应 体 系 中 加 入 荧 光 基 团 ， 利 用 荧 光信 号 积 累 实 时 监 测 整 个 PCR 进 程 ， 最 后 通 过 标 准 曲 线 对 未 知 模 板 进 行 定 量 分 析 的 方 法。1. Ct 值 的 定 义在 荧 光 定 量 PCR 技 术 中 ， 有 一 个 很 重 要 的 概 念 - Ct 值 。 C 代 表 Cycle， t 代 表threshold， Ct 值 的 含 义 是 ： 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 到 达 设 定 的 域 值 时 所 经 历 的 循 环数 （ 如 图 1 所 示 ） 。2. 荧

3、光 域 值 （ threshold） 的 设 定PCR 反 应 的 前 15 个 循 环 的 荧 光 信 号 作 为 荧 光 本 底 信 号 ， 荧 光 域 值 的 缺 省 设 置 是 3-15 个 循 环 的 荧 光 信 号 的 标 准 偏 差 的 10 倍 ， 即 ： threshold = 10 SDcycle 6-15 3. Ct 值 与 起 始 模 板 的 关 系研 究 表 明 ， 每 个 模 板 的 Ct 值 与 该 模 板 的 起 始 拷 贝 数 的 对 数 存 在 线 性 关 系 1， 起 始 拷 贝 数 越 多 ， Ct 值 越 小 。 利 用 已 知 起 始 拷 贝 数 的

4、 标 准 品 可 作 出 标 准 曲 线 ， 其 中横 坐 标 代 表 起 始 拷 贝 数 的 对 数 ， 纵 坐 标 代 Ct 值 （ 如 图 2 所 示 ） 。 因 此 ， 只 要 获 得 未知 样 品 的 Ct 值 ， 即 可 从 标 准 曲 线 上 计 算 出 该 样 品 的 起 始 拷 贝 数 。4. 荧 光 化 学荧 光 定 量 PCR 所 使 用 的 荧 光 化 学 可 分 为 两 种 ： 荧 光 探 针 和 荧 光 染 料 。 现 将 其 原 理简 述 如 下 ：1） TaqMan 荧 光 探 针 ： PCR 扩 增 时 在 加 入 一 对 引 物 的 同 时 加 入 一 个

5、特 异 性 的 荧光 探 针 ， 该 探 针 为 一 寡 核 苷 酸 ， 两 端 分 别 标 记 一 个 报 告 荧 光 基 团 和 一 个 淬 灭 荧 光 基 团 。探 针 完 整 时 ， 报 告 基 团 发 射 的 荧 光 信 号 被 淬 灭 基 团 吸 收 ； PCR 扩 增 时 ， Taq 酶 的 5 3外 切 酶 活 性 将 探 针 酶 切 降 解 ， 使 报 告 荧 光 基 团 和 淬 灭 荧 光 基 团 分 离 ， 从 而 荧 光 监 测系 统 可 接 收 到 荧 光 信 号 ， 即 每 扩 增 一 条 DNA 链 ， 就 有 一 个 荧 光 分 子 形 成 ， 实 现 了 荧光

6、 信 号 的 累 积 与 PCR 产 物 形 成 完 全 同 步 。 而 新 型 TaqMan-MGB 探 针 使 该 技 术 既 可进 行 基 因 定 量 分 析 ， 又 可 分 析 基 因 突 变 （ SNP） ， 有 望 成 为 基 因 诊 断 和 个 体 化 用 药 分析 的 首 选 技 术 平 台 。2） SYBR 荧 光 染 料 ： 在 PCR 反 应 体 系 中 ， 加 入 过 量 SYBR 荧 光 染 料 ， SYBR荧 光 染 料 特 异 性 地 掺 入 DNA 双 链 后 ， 发 射 荧 光 信 号 ， 而 不 掺 入 链 中 的 SYBR 染 料 分子 不 会 发 射 任

7、 何 荧 光 信 号 ， 从 而 保 证 荧 光 信 号 的 增 加 与 PCR 产 物 的 增 加 完 全 同 步 。二 内 标 在 传 统 定 量 中 的 意 义 1 几 种 传 统 定 量 PCR 方 法 简 介 ：1） 内 参 照 法 ： 在 不 同 的 PCR 反 应 管 中 加 入 已 定 量 的 内 标 和 引 物 ， 内 标 用 基 因 工程 方 法 合 成 。 上 游 引 物 用 荧 光 标 记 ， 下 游 引 物 不 标 记 。 在 模 板 扩 增 的 同 时 ， 内 标 也 被 扩增 。 在 PCR 产 物 中 ， 由 于 内 标 与 靶 模 板 的 长 度 不 同 ，

8、二 者 的 扩 增 产 物 可 用 电 泳 或 高 效液 相 分 离 开 来 ， 分 别 测 定 其 荧 光 强 度 ， 以 内 标 为 对 照 定 量 待 检 测 模 板 。2） 竞 争 法 ： 选 择 由 突 变 克 隆 产 生 的 含 有 一 个 新 内 切 位 点 的 外 源 竞 争 性 模 板 。 在 同一 反 应 管 中 ， 待 测 样 品 与 竞 争 模 板 用 同 一 对 引 物 同 时 扩 增 （ 其 中 一 个 引 物 为 荧 光 标 记 ）。 扩 增 后 用 内 切 酶 消 化 PCR 产 物 ， 竞 争 性 模 板 的 产 物 被 酶 解 为 两 个 片 段 ， 而 待

9、 测 模 板不 被 酶 切 ， 可 通 过 电 泳 或 高 效 液 相 将 两 种 产 物 分 开 ， 分 别 测 定 荧 光 强 度 ， 根 据 已 知 模 板推 测 未 知 模 板 的 起 始 拷 贝 数 。3） PCR ELISA 法 ： 利 用 地 高 辛 或 生 物 素 等 标 记 引 物 ， 扩 增 产 物 被 固 相 板 上 特 异的 探 针 所 结 合 ， 再 加 入 抗 地 高 辛 或 生 物 素 酶 标 抗 体 辣 根 过 氧 化 物 酶 结 合 物 ， 最 终 酶 使底 物 显 色 。 常 规 的 PCR ELISA 法 只 是 定 性 实 验 ， 若 加 入 内 标 ，

10、 作 出 标 准 曲 线 ， 也 可实 现 定 量 检 测 目 的 。2 内 标 在 传 统 定 量 中 的 作 用 由 于 传 统 定 量 方 法 都 是 终 点 检 测 ， 即 PCR 到 达 平台 期 后 进 行 检 测 ， 而 PCR 经 过 对 数 期 扩 增 到 达 平 台 期 时 ， 检 测 重 现 性 极 差 。 同 一 个 模板 在 96 孔 PCR 仪 上 做 96 次 重 复 实 验 ， 所 得 结 果 有 很 大 差 异 （ 见 图 4） ， 因 此 无 法直 接 从 终 点 产 物 量 推 算 出 起 始 模 板 量 。 加 入 内 标 后 ， 可 部 分 消 除 终

11、 产 物 定 量 所 造 成 的 不准 确 性 。 但 即 使 如 此 ， 传 统 的 定 量 方 法 也 都 只 能 算 作 半 定 量 、 粗 略 定 量 的 方 法 。 三 内 标 对 荧 光 定 量 PCR 的 影 响1 实 时 荧 光 定 量 PCR 无 需 内 标 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 有 效 地 解 决 了 传 统 定 量只 能 终 点 检 测 的 局 限 ， 实 现 了 每 一 轮 循 环 均 检 测 一 次 荧 光 信 号 的 强 度 ， 并 记 录 在 电 脑 软件 之 中 ， 通 过 对 每 个 样 品 Ct 值 的 计 算 ， 根 据 标 准 曲 线

12、获 得 定 量 结 果 。 因 此 ， 实 时 荧 光定 量 PCR 无 需 内 标 是 建 立 在 两 个 基 础 之 上 的 ：1） Ct 值 的 重 现 性 PCR 循 环 在 到 达 Ct 值 所 在 的 循 环 数 时 ， 刚 刚 进 入 真 正 的 指 数扩 增 期 （ 对 数 期 ） ， 此 时 微 小 误 差 尚 未 放 大 ， 因 此 Ct 值 的 重 现 性 极 好 ， 即 同 一 模 板不 同 时 间 扩 增 或 同 一 时 间 不 同 管 内 扩 增 ， 得 到 的 Ct 值 是 恒 定 的 。2） Ct 值 与 起 始 模 板 的 线 性 关 系 由 于 Ct 值 与

13、 起 始 模 板 的 对 数 存 在 线 性 关 系 ， 可 利用 标 准 曲 线 对 未 知 样 品 进 行 定 量 测 定 ， 因 此 ， 实 时 荧 光 定 量 PCR 是 一 种 采 用 外 标 准曲 线 定 量 的 方 法 。 2 内 标 对 实 时 荧 光 定 量 PCR 的 影 响若 在 待 测 样 品 中 加 入 已 知 起 始 拷 贝 数 的 内 标 ， 则 PCR 反 应 变 为 双 重 PCR， 双 重PCR 反 应 中 存 在 两 种 模 板 之 间 的 干 扰 和 竞 争 ， 尤 其 当 两 种 模 板 的 起 始 拷 贝 数 相 差 比 较大 时 ， 这 种 竞 争

14、 会 表 现 得 更 为 显 著 。 但 由 于 待 测 样 品 的 起 始 拷 贝 数 是 未 知 的 ， 所 以 无 法加 入 合 适 数 量 的 已 知 模 板 作 为 内 标 。 也 正 是 这 个 原 因 ， 传 统 定 量 方 法 虽 然 加 入 内 标 ， 但仍 然 只 是 一 种 半 定 量 的 方 法 。 美 国 Texas 大 学 的 科 研 人 员 进 行 了 外 标 法 定 量 和 内 标 法 定 量 的 方 法 学 比 较 ， 得 出的 结 论 是 ： 内 标 法 作 为 定 量 或 半 定 量 的 手 段 是 不 可 靠 的 ， 而 外 标 准 曲 线 的 定 量

15、方 法 是 一种 准 确 的 、 值 得 信 赖 的 科 学 方 。Applied Biosystems 公 司 的 7700 型 实 时 荧 光 定 量 PCR 仪 是 全 球 公 认 的 荧 光 定量 PCR 的 金 标 准 ， 可 实 现 多 色 荧 光 同 时 检 测 ， 但 定 量 检 测 仍 然 采 用 外 标 准 曲 线 的 方 法， 而 不 用 内 标 进 行 定 量 。综 上 所 述 ， 利 用 外 标 准 曲 线 的 实 时 荧 光 定 量 PCR 是 迄 今 为 止 定 量 最 准 确 ， 重 现性 最 好 的 定 量 方 法 ， 已 得 到 全 世 界 的 公 认 ，

16、广 泛 用 于 基 因 表 达 研 究 、 转 基 因 研 究 ， 药 物疗 效 考 核 、 病 原 体 检 测 等 诸 多 领 域 。由 于 qPCR 是 实 时 定 量 检 测 致 病 病 原 体 基 因 核 酸 ， 因 此 它 比 化 学 发 光 、 时 间 分 辨、 蛋 白 芯 片 等 免 疫 学 方 法 更 具 独 到 优 势 。技 术 原 理 ： 标 记 有 荧 光 素 的 Taqman 探 针 与 模 板 DNA 混 合 后 ， 完 成 高 温 变 性 ，低 温 复 性 ， 适 温 延 伸 的 热 循 环 ， 并 遵 守 聚 合 酶 链 反 应 规 律 ， 与 模 板 DNA 互 补 配 对 的Taqman 探 针 被 切 断 ， 荧 光 素 游 离 于 反 应 体 系 中 ， 在 特 定 光 激 发 下 发 出 荧 光 ， 随 着 循 环次 数 的 增 加 ， 被 扩 增 的 目 的 基 因 片 段 呈 指 数 规 律 增 长 ， 通 过 实 时 检 测 与 之 对 应 的 随 扩 增