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1、CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术CRISPR/Cas系统是由CRISPR基因座与其串联的Cas基因（CRISPR-associated genes, Cas genes）组成。根据CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白的种类和同源性，可将CRISPR/Cas 系统区分成3种类型，即类型I、和III，这3种类型标志基因分别是cas3、cas9 和cas10。在CRISPR/Cas系统中，类型 CRISPR/Cas系统组成最为简单，除了含有标志基因cas9外，还含有另外三个基因(casl,cas2,和csn2或者cas4)。CRISPR/Cas9系统由三部分组成：反式激活crRNA（
2、trans-activating crRNA，tracrRNA）、Cas基因（CRISPR-associated genes）和CRISPR基因座。1.反式激活crRNA反式激活crRNA是由反式激活crRNA的DNA序列转录的非编码序列。2. CRISPR 基因座典型的CRISPR基因座由3 部分组成：即位于5端的前导序列( leader，L)，高度保守的同向重复序列( directed repeat，R), 以及长度相似的间隔序列( spacer，S) 。Repeats含有回文序列，可以形成发卡结构。而Spacers比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“黑名
3、单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。而在上游的前导区(Leader)被认为是CRISPR序列的启动子。3. cas基因类型 II-A亚型的CRISPR/Cas 9系统中有4 个cas基因，分别为cas9、cas1、cas2和csn2，它们的表达产物主要发挥核酸酶切割作用。Cas9蛋白是CRISPR/Cas 9系统的标志性蛋白，由1409个氨基酸残基组成，包括-螺旋组成的识别区( REC)、由RuvC结构域与HNH结构域组成的核酸酶区以及位于C端的PAM结合区。Cas9与靶DNA的识别依赖于tracrRNA:crRNA复合体以及位于靶位点下游的PAM序列
4、。Cas9蛋白含有HNH和Ruv C功能域，HNH负责剪切与crRNA互补的DNA链，RucV负责剪切双链DNA的另一条链。由间隔序列相邻基序(protospaceradjacent motIf,PAM)指导Cas9蛋白可以精准的切割外源DNA。PAM位于结合区域的上游并与结合区域相邻，通常是NGG(N为任意核苷酸，G为鸟嘌呤)3个碱基。Cas 基因转录翻译为 Cas 蛋白，而 CRISPR 阵列经转录加工成更短的 CRISPR RNA (crRNA)，最后引导 Cas 蛋白降解靶核酸。微生物将从外源遗传物质中获得 spacer 序列，然后将其插入到自身的重复序列中。当外源 DNA 再次入侵时
5、，Cas 蛋白结合 crRNA 后会靶向到该 spacer 区域。识别 PAM 序列后，Cas 蛋白会将此外源 DNA 降解。CRISPR-Cas 系统产生切割必需 3 个条件：Cas蛋白、RNA 和 PAM。Cas 蛋白是发挥识别、切割的功能蛋白。而 PAM 被称为原型间区序列邻近基序，是 CRISPR-Cas 系统区分自我和入侵者的标记。当外源DNA入侵细菌时，CRISPR/Cas系统将其整合形成新的CRISPR重复回文序列。当外源DNA再次入侵时，重复序列中的CRISPR前体转录本在tracrRNA(trans-activating crRNA)的帮助下以及Cas核糖核酸内切酶的处理下形
6、成小的crRNA(crispr RNA)。在crRNA的引导下，Cas核糖核酸内切酶与外源DNA结合并将其裂解，达到防御的目的。CRISPR/Cas系统的主要特点在于能够记忆和识别入侵过的外源DNA，并对其特异性降解。（1）间隔序列获得：外来入侵的噬菌体或质粒DNA的一小段DNA序列被整合到宿主菌CRRSPR基因座的5端的两个同向重复序列之间。（2）crRNA的产生：CRISPR基因座首先被转录产生非编码的前体pre-crRNAs，反式激活tracrRNA与pre-crRNA结合形成tracrRNA:pre-crRNA双链复合物。该复合物在Cas9的存在下，双链RNA特异的核糖核酸内切酶RNa
7、se III进一步切割，最终产生成熟的crRNAs。（3）免疫干扰：crRNA:tracrRNA:Cas9三元复合物扫描外源入侵DNA，当遇到原间区序列邻近基序（PAM），且DNA序列可与crRNA互补配对形成一个R环时，Cas9蛋白将分别利用HNH与RuvC结构域核酸内切酶活性对DNA的互补链与非互补链进行切割，而形成DNA的双链断裂。在实际操作中，为了更加简单的操作，Jinek 等通过接头将 crNA 和tracrNA 合并成为 1 条 NA 链，从而形成单一指导NA ( single guideNA，sgNA)。人工设计 gNA时，结合的区域也就是 20nt，其位于 gNA 的5末端，作
8、为指导序列靶序列互补配对。简单来说，改造后的CISP/Cas9 系统仅需要在 sgNA 指导下，就能完成Cas9 蛋白对特定位点的剪切在基因敲除中的应用：CRISPR/Cas9系统在基因组的靶基因位点产生DNA双链断裂后，当修复模板序列不存在时，宿主细胞启动非同源性末端连接修复途径（NHEJ途径)，导致基因功能失活。CRISPR /Cas9 可以产生与目标序列互补的 RNA序列，并通过碱基互补配对的方式形成 NADNA 结构，之后，使 Cas9 核酸内切酶对靶 DNA 剪切形成双链断裂的 DNA (double strand break，DSB)。产生的DSB 可以通过同源定向修复 (homo
9、logydirected repair，HD) 途径修复，也可以通过非同源末端链接(nonhomologous end joining， NHEJ ) 途 径 修 复。CRISPR /Cas9 系统的作用机制可以总结为以下 3 步。第 1 步外源 DNA 的入侵，外来的 DNA 首先被 Cas 蛋白识别，并随后整合到 CRISPR 位点的 2 个相邻的重复序列之间的间隔。第 2 步CRISPRRNA 的产生，当外源物质再次入侵时，整合了外源 DNA 片段的 CRISPR 基因座转录生成 precrRNA 和 tracrRNA， precrNA 被 核 酸 酶 与tracrNA 切割形成成熟的 crRNA。第 3 步CRISPR /Cas9 系统剪接，pre crNA 和 crNAs形成复合物，通过碱基互补配对原则特异性识别外来的 DNA (或RNA) ，这种复合物降解外来 DNA 并维持噬菌体的免疫，此外，Cas9 蛋白还可以与复合物形成结合，识别外来 DNA 序列上的 PAM 序列，行使剪接功能 。
