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1、实验四、姊妹染色单体分染技术（学时）（综合性、设计性实验） 一、实验目的和要求 了解姊妹染色单体差别染色技术的原理和制作标本的方法，并通过标本的观察，掌握计数方法。,二、实验原理 在复制过程中，核苷的类似物溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）能代替胸腺嘧啶进入到新合成的链中，植物根尖在含有适当Brdu的培养液中生长二个分裂周期后，中期染色体的两条染色单体在化学组成上有了差别，一条染色单体的两条链均为新合成的，因此位完全由Brdu代替，另一条染色单体的一条链是新合成的，所以只有一条中含有Brdu，这样的细胞经染色后，一条为深染，一条为淡染，所以称之为姊妹染色单体的差别染色。本实验运用这一原理，利用大蒜根
2、尖作为材料，经过适当处理制片，可观察到姊妹染色单体分染现象。,姊妹染色单体区分染色法中使用的诱变剂是什么？原理是什么？5-Brdu。旺盛分裂的组织细胞，由于细胞分裂旺盛，DNA的合成量大，会出现核苷酸短缺的情况，5-Brdu与碱基中的尿嘧啶结构相似，会掺入到DNA合成链中与腺嘌呤配对，而在后续的合成中，5-Brdu会和5-Brdu结合形成紧密结合。当用HCl解离DNA时，会有醛基暴露出来，而使用改良的席夫试剂中含有的无色SO2会和醛基结合形成紫色基团。但是掺入了5-Brdu的DNA链不易被解离，所以不易形成紫色基团。在显微镜下就可见染色深浅不一的姊妹染色单体,孚尔根染色法是鉴别细胞中DNA反应
3、的组织化学方法。细胞内的DNA(通常位于核及染色体上)在1N HCl 60水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键而使嘌呤碱脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基获得了自由状态。而无色的亚硫酸品红是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开，碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去染经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的醛基结合，又出现了呈现红色的醌式结构，从而使DNA分子着色。这一反应是1924年由Feulgen 和Rossonbek 所发现和确定的，已广泛用作鉴别DN
4、A的一种特异性检查方法。,水解是本实验成败的关键之一。温度应保持在600.5之间(用两支温度计相互校正)。如果温度过低或时间过短，酸解不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；若温度过高或时间过长，会造成酸解过度，使DNA完全解聚，糖与醛基之间的键被破坏，游离的核酸分子会扩散到细胞质中，从而造成染色浅或不均一的现象。 水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程。第一，嘌呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来。第二，组蛋白和核酸越来越多地被除掉。在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用Schiff试剂染色，染色体的染色作用最强。随水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的
5、Schiff反应增强，而染色体中的Schiff反应减弱。最后，第二个过程超过第一个过程时，染色体也随之停止反应。,RNA分子中也有嘌呤碱，那么经酸解后，用Schiff试剂染色时，为什么不能使RNA分子着色呢？这是由于在酸解的情况下，RNA分子较DNA分子稳定，它的醛基难以游离出来。所以，利用孚尔根法染色时，只能使DNA分子着色而不能使RNA分子着色。,影响孚尔根反应的主要因素有以下几个方面： (1)水解时间和温度： 这是实验的主要关键。水解适当时，染色体着色较深而细胞质不显颜色，水解不足，染色体着色浅淡，细胞质中可能有其他醛基存在而显示扩散的红色。水解过度，则染色体着色不匀，这是由于DNA解聚
6、而产生的游离核酸分子从染色体扩散到细胞质中，使细胞普遍着色。随着时间的过度，会使水解液中的反应增强，而细胞不能着色。 (2)固定液的成分： 不同成分的固定液常出现不同的颜色反应。含铬酸的固定液产生红色，酒精-醋酸固定液产生红色、紫红色，只用酒精的呈现紫色，用含甲醛的固定液则呈现强烈的紫红色。当需要对染色体中的DNA 定量测量时，一般只能用不含金属离子和甲醛的固定液，如酒精-醋酸固定液等。,(3)SO2含量： Schiff试剂中的SO2含量也影响孚尔根反应的颜色表现。SO2含量低时呈红色，含量高时则偏向蓝色。 (4)染色质中DNA的含量： 供试材料的染色质中DNA含量的不同是影响显色反应强度的根
7、本因素。不同生物和不同的组织与细胞中DNA含量不同，显色强度也各异，并且二者之间是正相关的。由于上述因素和实践了解，具有大、中型染色体的材料，如百合科及部分禾本科植物材料，适于用孚尔根反应，小型染色体的材料特别如玉米、水稻等不适于用孚尔根法染色，它们的染色体用孚尔根法时着色是很浅的。,三、实验器具、药品试剂 大蒜（Allium sativum, 2n=16) Schiff 试剂: 取碱性品红1g，放入200ml煮沸的蒸馏水中，用玻璃棒搅拌使其充分溶解。冷至50时过虑，加入1mol/L盐酸20ml于溶液内，冷却到20-25，加入偏亚硫酸钠（钾）Na2S2O3（或无水亚硫酸氢钠NaHSO3）1-2
8、g，封闭瓶口，置于暗处12-24小时，液体应成淡黄色或无色，若颜色过深可加适量活性炭，过滤后贮于暗处。 500mol/L BrdU溶液：15.4mgBrdU加水100ml，装入棕色试剂瓶中，包黑纸避光，4保存。 0.05秋水仙碱溶液：5mg秋水仙碱溶于100ml蒸馏水中。 1mol/L HCl。,四、操作步骤 1生根： 将搪瓷盘的盘口用线绳编织成许多网格，在盘内注人清水。把大蒜的鳞茎洗干净，用刀片将鳞茎上的老根削除，再把其放在搪瓷盘的网格上，使其生根部位恰好接触到水面，在25下培养几日至根尖长1.5-2cm。 2. BrdU处理： 将大蒜幼苗转入盛有500mol/L BrdU溶液的青霉素瓶中，
9、继续25黑暗培养34-36小时。,3、预处理： 剪取根端（约0.5-1cm长），浸入0.05的秋水仙素溶液预处理3.5-4小时； 4、固定： 转入卡诺氏液（冰醋酸：甲醇1：3）固定2-3小时；于70乙醇中保存。 5、HCL溶液离解： 1）取经预处理并固定好的大蒜根尖，用水洗3分钟，放入室温条件下的1mol/L HCl处理根尖材料3分钟。 2）将根尖换入60预热的1mol/L HCl，置于恒温水浴中，在600.5的条件下水解10分钟。,6、染色： 置室温1mol/L HCl再处理2分钟，然后水洗3次，吸净水分，加入Schiff试剂，在黑暗条件下染色30分钟直到根尖呈现深紫红色 。 7、压片：用水
10、漂洗3分钟，去掉细胞中残存的一些有色的品红分子。取根尖置载玻片上，用镊子夹碎后，加一滴45醋酸，然后盖上盖片。用右手持解剖针以针尖轻轻敲击盖玻片，将盖玻片下的小气泡逐渐赶去，同时使处理均匀分散，然后覆上两层吸水纸，以解剖针的木柄端（或用铅笔上的橡皮头）敲击，使细胞进一步分离铺展。,8、镜检观察: 选择染色体分散的离散细胞进行观察，在高倍镜下即能看清姊妹染色单体间呈现的浓淡差别。部分染色体上出现自发的姊妹染色单体互换，凡在染色单体端部出现的互换计为一个SCE，在中部出现的互换计为两个SCE。,五、实验说明 本实验需要综合应用到遗传学、动物学、植物学等相关知识。 1. BrdU的参入是姊妹染色单体区分的重要基础。由于植物种子萌发过程中自身合成的胸苷与外来的BrdU发生竞争性矛盾，所以若处理不当往往会造成参入不进，导致实验失败。因此一要注意选择饱满。发芽势强的蚕豆种子；二是要注意抓住插入的时机，一定要在大多数侧根长0.5-1.5cm时开始参入，因为此时侧根和幼芽的生长是最旺盛时期，BrdU易参入复制。,六、作业和思考 1. 绘制一个中期染色体形态图，并标明染色单体的颜色深浅。 2. 为什么姊妹染色单体差别染色技术可以检测环境污染？,人体淋巴细胞姐妹染色单体互换,
