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1、细菌DNA的提取和纯化,轻工与食品学院 制糖工程 丁雄,1、DNA,DNA是脱氧核糖核酸英文名deoxyribonucleic acid的缩写，是一种带有遗传信息的长链聚合物的生物大分子，由4种主要的脱氧核苷酸(dAMP、dGMP、dCMT和dTMP)通过3，5-磷酸二酯键连接而成。它们的组成和排列不同，显示不同的生物功能，如编码功能、复制和转录的调控功能等。,2、细菌DNA,因为细菌细胞大多数是没有细胞核的原核生物，所以细菌DNA大多数集中在细胞质中低电子密度区，称之为核质体。核质体是环状的双链DNA分子，所含的遗传信息量可编码20003000种蛋白质，空间构建十分精简，没有内含子。由于没有
2、核膜，因此DNA的复制、RNA的转录与蛋白质的合成可同时进行,核质体（浅绿色）,2、细菌DNA,除核质体区DNA外，细菌细胞质中还有能进行自主复制的遗传因子质粒（plasmid）。 质粒是裸露的环状双链DNA分子，所含遗传信息量为2200个基因，能进行自我复制，有时能整合到核DNA中去。质粒DNA在遗传工程研究中很重要，常用作基因重组与基因转移的载体。,3、细菌DNA抽提的总原则,（1） 保证核酸一级结构的完整性； （2） 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度； （3） 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； （4） 其他核酸分子，如RNA，
3、也应尽量去除。,4、细菌DNA的抽提过程,破裂细胞 核酸释放 核酸的分离和纯化 核酸的鉴定和保存,4.1 破裂细胞,主要是破裂细胞壁。 细菌的细胞壁厚度因细菌种类不同而有所差别。革兰氏阳性菌细胞壁较厚，有15-50层肽聚糖、磷壁酸和少量蛋白质；革兰氏阴性菌细胞壁相对较薄，肽聚糖仅2-3层，容易破裂,4.1 破裂细胞壁,常用破裂细菌细胞壁的方法： （1）机械法： 高压匀浆破碎法（homogenization） 振荡珠击破碎法 (Shaking Bead) 高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）,4.1 破裂细胞壁,（2）非机械法 渗透压
4、冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing） 酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 去垢剂破碎法（detergents） 实验室常用的方法是采用酶溶破解法来破裂细菌细胞壁,4.2 核酸的分离和纯化,就是从含有核酸分子的复杂复合物中，将核酸与其他物质分离。常见的污染物有：非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液。大致有三个过程： 浓缩 沉淀 洗涤,4.2 核酸的分离和纯化,常加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）进行浓缩； 然后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）
5、进行沉淀，可去除部分杂质与某些盐离子等； 再之后，使用70-75%的乙醇洗涤。,4.3 核酸的鉴定,核酸的鉴定：主要有包括三个方面 A 浓度鉴定 B 纯度鉴定 C 完整性鉴定,4.3 核酸的鉴定,浓度鉴定 法一：紫外分光光度法 测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260稀释倍数50 ？ g/ml 该方法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,4.3 核酸的鉴定,法二：荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。,4.3 核酸的鉴定,纯度鉴定 紫外分光光度法： 在260nm和280nm处
6、测定DAN溶液的光吸收，A260与A280之比应在1.80。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。A260/A280比值是纯度检测的重要指标。,4.3 核酸的鉴定,完整性鉴定 凝胶电泳法： 基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象； 总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。,4.4 核酸的保存,（1） 短期贮存： 4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 （2）长期贮存： TE缓冲液中-70保存数年； 另外，可在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,5、常见
7、细菌DNA的提取方法,以革兰式阳性菌E.coli为例 常用有三种方法： A、水煮模板法主要用于PCR反应 B、CTAB/NaCl 法 C、盐析法,5.1 水煮模板法,接种单菌落于LB或BHI平板，连续画线，37 培养1824h。 刮取12接种环菌苔加入150三蒸水中，混匀，100 煮沸10min。 12000r/min 离心10min，取上清，20 保存备用。,5.1 水煮模板法,方法评价： （1）优点：操作最简便，对试剂条件要求低； （2）缺点：缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。 但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。 此法得到的模版保存时间短，强烈建议每月重新制作一
8、次。,5.2 CTAB/NaCl法,接种一单菌落于5ml LB中,30培养过夜 取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37、220r/min培养16小时 5000r/min离心10分钟,弃去上清。 加入10ml TE离心洗涤后,用10ml TE溶解菌体,混匀,-20保存备用,5.2 CTAB/NaCl法,取3.5ml菌悬液,加入184l10%SDS,混匀,加入37l10mg/ml蛋白酶K,混匀,37温育1小时 加入740l5mol/LNaCl,再加入512lCTAB/NaCl,混匀,65温育10分钟,5.2 CTAB/NaCl法,加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5
9、分钟,保留上清。 上清中加入等体积的酚氯仿异戊醇(25241),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。,5.2 CTAB/NaCl法,加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。 用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20g/mlRNaseA,4保存。,5.2 CTAB/NaCl法,该方法的评价： （1）优点：DNA纯度较高，蛋白质杂质较少，保存时间也长。 （2）缺点：试剂要求高，操作繁琐。操作必须仔细认真。 该方法可等同一般的试剂盒提取DNA的方法。,5.3 盐析法,5.3 盐析法,5.3 盐析法,5.3 盐析法,方法评价： 介于方法一和方法二之间，CTAB虽然取出糖分效果较好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。,6、革兰氏阳性菌DNA提取,7、注意事项,（1）提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑），以免枪头损伤基因组 （2）抽干时最好是风干！ （3）较精细的实验，如Southern，强烈推荐用试剂盒！,到此为止，谢谢聆听！,
