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1、PCR产物的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收,限制性内切核酸酶消化DNA,限制性内切核酸酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上3-8个特定核苷酸序列并产生切割反应的内切核酸酶(endonuclease)的总称。在基因操作中，这些酶作为“剪刀”对DNA起剪切作用，是分子生物学研究中不可缺少的酶之一。,限制内切酶切出的三种断口,在酶切实验中：,如果用同一种酶切割载体和插入DNA两者能正确连接，但不能确定方向。 如果用同的限制酶切割，所得的单链突起能互补，则两者能正确连接。但也不能确定其方向。 若限制酶切割所得的片段是平末端，虽能连接，但效率低，而且不能确定其方向。 用两种不同的限制
2、酶共同切割载体和插入片断，而且所得两末端结构不同，连接后就能确定其方向。 因此，运用两种不同的限制酶的模式被广泛应用。,在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是BamH I 和Hind III ，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物与载体正确的连接。,酶切体系,PCR产物 0.5g Buffer K（10X） 5l ddH2O加至 48l BamH（20U/ul） 1l Hind III （20U/ul） 1l 总体积 50l,将酶切体系按顺序加好后柔和混匀，放入已预热的37的水浴锅（或37培养箱）中，使反应体系在这个温度下进行酶切。,在酶切实验中需要注意的事项,1 反应
3、Buffer 2 酶切位点的保护碱基 3 酶切反应温度 4 酶切体系的体积,每一种酶都具有相应的反应缓冲液，反应缓冲液可能相同也可能不同。一般同一公司的酶的缓冲液可以通用，不同公司的一般不相同。 若不同酶使用相同的缓冲液，则可同时加入，若使用不同的缓冲液，则只能在第一个酶切完成后，进行酚抽提，乙醇沉淀，再进行另一个酶的消化。,保护碱基,限制性内切酶的酶切位点两侧的保护碱基是在设计PCR的引物时加入的。 BamH 的保护碱基 ATTGGATCCATGGCGAATTCCGGCGAAGA Hind III的保护碱基 ACCAAGCTTGATGGTGGAAGAAGGAGC,酶切反应温度,C对于大多数酶
4、来说是最佳反应温度。 实验中应注意反应的温度。在我们的实验中使用水浴锅提供酶反应的温度，但是由于水浴锅中离心管底部的温度与管顶的温度不同，易造成反应体系的蒸发，这样会造成酶反应条件的改变，可能会造成酶产生星活力。因此，如酶反应时间较短，在两小时左右，可在水浴锅内进行，如时间较长，最好在培养箱内进行反应，可避免水分蒸发和凝结。,25 C,37 C,酶切体系的体积,我们今天的酶切体系是50l。在反应中加入的酶量不能超过总体积的十分之一。 并不是在酶切中加入的酶越多越好，因为在酶的储存液中含有甘油，甘油可以保护酶，防止酶结冰，失去活性。而当甘油达到一定的浓度，（在反应体系中10%），就会影响酶，产生
5、星活力，切割出我们不需要的片段。,星号活力,又称为第二活力，是指改变了酶切反应条件后特意序列的识别特性降低的一种现象。由于识别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割。如EcoR 的典型识别序列为 GAATTC，条件改变后，其识别序列由原来的六核苷酸降为四核苷酸 AATT。高浓度甘油、高PH、低离子强度、DMSO、-巯基乙醇、Mn2+ 等的存在可能导致酶产生星活力。,2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。,上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发
6、现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。,1) 寄主控制的限制与修饰现象,限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修
7、饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。,2)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的亚基组成和切断核酸情况 的不同，分为三类： 型 型* 型,第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。,第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片
8、段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：,交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键。 如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5 在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AAT
9、TC3 3CTTAA G5 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,粘性末端：,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,3）II类限制修饰酶命名规则： 生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称 基本名称 + 菌株名的字母 + 罗马字母（发现顺序） Hind III Haemophilus infuenzae
10、d株中的第三个酶 EcoR I 基因位于Escherichia coli 抗药性R质粒上 E co R I 细菌属名 细菌种名种 菌株类型 有几种限制酶,同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。 同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是 5G|CG G3 3G GC|G5 如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割。,同裂酶和同尾酶：,有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶 同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端
11、连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。,同尾酶：,如BamHI和BglII: 5G|GATCC3 5A|GATCT3 3CCTAG|G5 3TCTAG|A5 5G GATCC3 5A GATCT3 3CCTAG G5 3TCTAG A5 5GGATCT3 3CCTAGA5 这些粘性末端连接后， BamHI和BglII酶将不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为GATC)来进行再切割。,3. 酶切反应的设计一般应注意问题:,大多数限制酶贮存在50甘油溶液中，以避免在-20条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度过高时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑制酶活性。 酶切底物DNA应具备一定的纯度，其
12、溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。 反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。,4. 酶切实验中的注意事项: 反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在室温的放置时间。 反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。 反应前的低速
13、离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。 终止酶反应可根据需要采用不同的方法： 酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应。 若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65保温20-30分钟，以灭活酶，终止反应。 可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。,从琼脂糖凝胶中回收DNA,在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些小片段，这些小片段具有和目的片断同样的黏性末端，也可能会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳。,离心柱法回收凝胶中的DNA,紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条置于1.5ml离心管中
14、； 加入3体积溶胶液，5060数分钟直至无可见凝胶块； 冷却至室温； 加入到离心吸附柱中，室温放置1min后，500010000rpm 15min使液体滤过；倒掉离心管中液体； 向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm 2min洗涤一次；倒掉离心管中液体 向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm 2min洗涤一次；倒掉离心管中液体； 将离心柱放入离心管中12000rpm 2min； 将离心柱放入新的1.5ml离心管中，向离心柱中滤膜上加入2030ul洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心3min，液体中即为回收的核酸。,注意事项,电泳所用的胶的浓度为0.7%，易于回收核酸。 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。 在切胶时，要注意尽量沿目的片段的边缘切下，使其所带的琼脂糖尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。,
