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1、玉米浆对林可霉素生物合成影响的研究摘要:采用BioFlo-110L中试生物反应器,通过在线、离线参数等关联分析,发现玉米浆用量对林可霉素生物合成调控很关键。适量补入玉米浆,可以增加三羧酸循环通量,强化菌体维持代谢和次级代谢,发酵单位较原工艺增长8.59%;将中试实验结果应用到63t生产罐实验,发酵单位增长6.32%。关键词:王米浆;林可霉素;生物合成林可霉素生物合成途径推测途径已有文献报道,即先由两个独立途径分别完成1,一是L-酪氨酸合成丙脯氨酸,一条是由景天糖-7-磷酸合成a-甲硫林可霉素,两个亚基经缩合再甲基化生成。林可霉素分子式C18H34N2O6S,不含磷,但在合成途径中,磷起着重要调
2、节作用2,高浓度磷酸盐能刺激微生物的生长繁殖,而抑制多种抗生素生物合成3。NH4+是微生物易利用的氮源,能促进细胞的生长繁殖,同时能产生铵阻遏效应4。在林可霉素实际生产中,主要通过对氮源和磷源的调节,实现对发酵的控制,采用原料主要为玉米浆和硫酸铵,其中玉米浆含有丰富的氨基酸、生物素、可溶性磷和维生素,将玉米浆加入到发酵液后,可提高辅酶Q合成量,增加细胞呼吸强度5。林可霉素发酵过程中,中后期次级代谢强度变弱现象十分普遍。本研究采用BioFlo-110L中试生物反应器开展实验,改变玉米浆补料量,对采集到的参数结合生物合成原理分析,确定了玉米浆的最佳调控方案,改善了生产中的“后劲”不足。1材料与方法
3、1.1菌种林可链霉菌(S. lincolnensis)。1.2培养基配方(略)1.3培养条件与培养办法1.3.1110L罐培养条件与办法(略)1.3.2 63t罐培养条件和办法(略)2结果与讨论2.1发酵中后期次级代谢变弱现象对各低产和高产罐各30批产量统计,发现低产罐前期发酵特征与高产罐相似,中后期分化明显,低产罐产率下降快。显微镜下对低产罐菌丝形态进行观察,变化过程为:菌丝团网逐渐消失,新生菌丝减少,残片段多,自溶时间早。2.2玉米浆对发酵过程的调控作用研究在110L罐上进行了5批中试,记为A1、A2、A3、A4、A5,并保持前80小时工艺相同。80h后工艺:A1、A2、A3、A4、A5每
4、小时补入玉米浆7ml、13ml(原工艺)、19ml、25ml、31ml。各罐细胞干重(DCW)变化如图1。A1罐,100h后DCW明显下降,放罐下降至38.45 g/L;88h后产率变小,放罐产量6260?g/ml。A2罐,100h后DCW缓慢下降,放罐下降至39.34g/L;136h后产率变小,放罐产量6615?g/ml。A3罐,80h后DCW稳定,保持在41g/L左右;136h后产率变小,放罐产量7188?g/ml。A4罐,80h后DCW一直上升,放罐至43.46g/L;112h后单位增长慢,放罐产量6798?g/ml。A5罐,80-124hDCW缓慢上升,124h升至39.34g/L,之
5、后缓慢下降,放罐降至40.6 g/L;88h后产率变小,放罐产量为6395?g/ml。 首先,对各罐菌丝形态分析A1罐80h后菌丝网逐渐减少,菌丝变细变短,后期断片状。A2罐菌丝形态相对改善,75-136h,菌丝呈团网,菌丝长但细, 136h后细且短。A3罐中后期呈大团网状,菌丝粗且长,伸展有空泡A4罐中后期菌丝粗长,着色较深,看不到空泡,出现返青现象A5罐中期菌丝粗长,后期短粗,一直着色深。其次,对各个罐林可霉素平均比生长速率(?)进行比较。由图1可以看出随着玉米浆补入量的增大,?也增大。A1罐的?最小,显然是由于补入玉米浆量太低,不能满足林可霉素菌进行维持代谢的需要,导致菌体生理活性降低,
6、菌浓降低,次级代谢水平也随着降低;A2相对改善,但仍不足;A3中后期保持小的正?(0.0025/h),期间产率增量最大,说明菌体维持代谢和次级代谢水平较高。A4中后期?最大,说明玉米浆补入量偏大,过量的补入导致菌体基础代谢水平高,而次级代谢水平降低。A5由于补入玉米浆量过大,中后期基础代谢水平增高,但玉米浆含高浓度NH4+和RS,第一由于铵离子阻遏效应,使林可霉素产抗菌的谷氨酰胺合成酶的比活力降低,会使菌体初级和次级代谢都受到负面影响;第二产抗菌在高氮源环境中,菌丝抗剪切力降低,在搅拌桨叶作用下,菌丝断裂;第三由于玉米浆的PH低,而且菌体对高RS的利用使发酵液PH降至很低水平,使发酵后期PH波
7、动大,最终导致后期?值为负。2.2.2实时曲线分析由上分析可知A1为典型低产罐,A3为高产罐,在发酵中后期A3和A1罐的林可霉素产抗菌的OUR逐渐拉开差距。A3在OUR平台20mmol/Lh左右,RQ维持在0.75左右,A1在OUR平台10mmol/Lh左右,RQ基本在0.65以下。说明A1在发酵中后期菌丝呼吸强度变小,维持代谢变弱,而A3菌丝活力一直较强,维持代谢较稳定,为菌体进行高水平的次级代谢提供了基本保障。2.3新工艺在63t罐的放大实验将A3罐控制工艺放大至63吨生产罐实验,验证三批,菌丝形态得到很大改善,放罐时平均效价7108?g/ml,较实验前提高了6.32%。3结论以 110L
8、发酵反应器为设备,用林可链霉菌发酵生产林可霉素,单位较原工艺增长8.66%,最终确定了最佳玉米浆补料方案。63t罐放大验证3个批次,发酵产量增幅为6.32%。参考文献1Peschke U characterization of thelincornycin-productiongene cluster of S.linconnensis78-11J.Mol microbial2李小兵.林可霉素发酵过程中磷的调控.中国医药工业杂志3张嗣良,储炬,多尺度微生物过程优化。北京:化学工业出版社4金?,焦瑞身,硝酸盐,镁盐对林可霉素生物合成的促进作用5陈坚,堵国成,卫功元等。微生物重要代谢产物-发酵生产与过程解析。北京:化学工业出版社