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1、当进行工艺放大时， “细胞”都在谈论什么？当进行工艺放大时， “细胞”都在谈论什么？ 关键词：P/V；Mixing time；KLa；CO2 stripping 细胞培养的小试工艺确定后， 如何保证规模扩大后细胞生长、 产品产量及质 量的稳定性是一个新的考验。 简单的说， 工艺放大主要是保证细胞所处的环境不 变，那么工艺放大过程中“细胞”在意的主要有哪些参数？影响细胞环境的参数 主要有：P/V、Mixing time、KLa 和 CO2 stripping。工艺放大时常会根据这些参数 进行放大， 但有时不仅依靠单一因素进行放大， 还会将两个或多个因素结合起来 进行放大。 P/V 单位体积功耗比
2、（P/V，Power / Volume） ，一定程度表示混合程度，P/V 值 直接影响物料混合及传质。P/V 分为平均 P/V 和最大 P/V，平均 P/V 可以测定 反应器的总输入功率，最大局部 P/V 表现最高比能量耗散速率。工艺放大时 P/V 可以单独使用，也可以与 kLa、vvm 一起使用。 P/V 计算公式如下： 其中，Po：功率指数；：液体密度（kg/m3） ；N：搅拌速率（s-1） ；Di：搅 拌桨直径（m） ；V：培养体积。其中，Po通常由供应商提供。 不同规模反应器参考参数（图表来源：A-Mab Cass Study） Mixing time 表征体系达到均质所需的时间，通过
3、体系中添加一种标记物（如，盐、染 料、放射性材料等）时，测定其达到 95%均质状态所需的时间，即为混合时 2L Standard Scale-Down Model 2L Process Characterization Studies500 L1000 L5000 L15000 L 25000L( Future) Average P/V (W/m3)2.82.8-30.213.628.227.42625.6 Max local P/V (W/m3)5.955.95-47.62560545252 KLa(hr-1)108-17810102020 Mixing time(s)2013-4548.3
4、43628191 CO2 stripping time11-51.51.742.12.3 间。 为使测量模型更适应于细胞培养环境，推荐使用 NaOH 作为标记物，测量 过程中采用两个 pH 电极测两个不同点的 pH 值，pH 安装及 NaOH 添加位置如 下图。 电极安装及 NaOH 添加位置（图表来源：Scale-Up Analysis for a CHO Cell Culture Processin Large-Scale Bioreactors） 下面图 A 表示标记物 NaOH 添加后，通过 pH（上面和下面的探头）的变化 表示体系从均质变为非均质， 再变为均质的过程。 图 B 为混合
5、时间的计算方法， t=(t1+t2)/2。一般情况下，反应器规模越大，混合时间越长；混合时间与通气策略 没有关系，而是由搅拌速率决定的，但混合时间会影响体系中的 DO 和 pH（规 模较大时） ，进而影响细胞生长。 （图表来源：Scale-Up Analysis for a CHO Cell Culture Processin Large-Scale Bioreactors） 氧气传质系数氧气传质系数（KLa） KLa，表征氧气从气相进入到液相的速率，影响 kLa 的因素有很多，如液相 性能、气泡大小、体系几何结构和操作参数等。由于氧气在水中的低溶解度， 氧气传质速率（OTR）一直是好氧微生物
6、培养的重要参数。细胞培养过程中， 氧气从气泡进入细胞分为两个过程：1）从气相进入液相；2）从液相进入细 胞，可以用氧气传质速率（OTR）和氧气吸收速率（OUR）表示。 氧气从气泡进入细胞的过程（图表来源：Bioreactor Scale-Up and Oxygen Transfer Ratein Microbial Processes: An Overview） 由体系中氧气质量平衡可知：dCL/dt=OTR-OUR；CL为液相溶氧浓度。根 据双膜理论和亨利定律，OTR=kLa(hCB-CL)，CB为气相氧浓度，kLa 为氧气传质 系数。则 dCL/dt=kLa(hCB-CL)-OUR。 测定
7、 kLa 可以采用化学和物理方法。通过化学反应（亚硫酸钠法）可以测定 OTR 和 kLa，测定的值一般比正常要高，因为化学反应的快速性。众多测定 kLa 的物理方法中， 常见的为动态测定模型， 而此时又分为两种情况： 1） 考虑 OUR， 模拟细胞培养过程， 在活细胞存在的条件下， 一定时间内停止泵入氧气， 将 OUR 和OTR分隔开测定。 第一阶段确定OUR， 第二阶段根据OUR和DO再测定kLa； 2）不考虑 OUR，体系中没有活细胞，通往氮气降低溶氧，第一阶段省略，仅用 测定第二阶段。 物理法测定 kLa（图表来源：An Improved Dynamic Method to Measur
8、e kLa in Bioreactors） CO2 stripping CO2 stripping，表示体系中移除 CO2的能力，即维持体系中 pCO2水平的能 力。不同细胞系的最佳 pCO2均不同，当体系中 CO2累积增加导致 pCO2升高时不 仅对细胞生长和蛋白产生影响，而且还会影响蛋白的质量如糖基化水平等。 vvm 较低时（0.002） ，kLaCO2（CO2传质系数，测定方法与 kLa 类似）还不 能达到 kLa 的 15%，且随着反应器规模的扩大 kLaCO2越低，即 CO2 stripping 越 低。体系中气体饱和度和气泡量直接影响 CO2 stripping，提高 vvm 及气
9、泡停留 时间可以加快移除，搅拌转速与 CO2 stripping 关系不大。 参考文献： 1. A-Mab Cass Study 2. Scale-Up Analysis for a CHO Cell Culture Processin Large-Scale Bioreactors 3. An Improved Dynamic Method to Measure kLa in Bioreactors 4. Bioreactor Scale-Up and Oxygen Transfer Ratein Microbial Processes: An Overview 5. A practical approach in bioreactor scale-up and process transfer using a combination of constant P/V and vvm as the criterion 文章首发 CPhi.CN 制药在线
