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1、生物药剂学药代动力学研究方法摘要：气-质联用法综合了气相色谱和质谱的优点，得到了更广泛的应用。生命科学前沿领域的技术也逐渐用于药学领域的研究,如Caco-2细胞模型、微透析技术等在生物药剂学及药物代谢动力学方面发挥了重要作用。关键词：生物药剂学 药物代谢动力学 气-质联用法 Caco-2细胞模型 微透析技术 ABSTRACT: GC-MS chromatography and mass spectrometry advantages, has been more widely used. Front fields of life science technology is gradually
2、used in pharmaceutical fields of study, such as a Caco-2 cell model, the microdialysis technique in biopharmaceutics and pharmacokinetics plays an important role in.Key words: Biologicalpharmacy GC-MS Caco-2 cellmodel Microdialysis 前言生物药剂学是研究给药后药物从吸收到消除的整个体内过程，以及各种制剂因素和生物因素对这一过程和药效的影响。 1950年代初，人们普遍认
3、为“化学结构决定药效”，药剂学只是为改善外观、掩盖不良嗅味而便于服用。随着大量的临床实践证明，人们逐渐开始认识到机型和生物因素对药效的影响。因此研究药物在代谢过程的各种机理和理论及各种剂型和生物因素对药效的影响，对控制药物之际的内在质量，确保最终药品的安全有效，提供新药开发和临床用药的严格评价，都具有重要的意义。进年来, 生命科学前沿领域如基因组、蛋白质组、生物芯片、纳米技术、转基因生物、生命信息等高新技术大量用于药学研究, 新兴学科越来越多地深入到新药的发现和研究中, 化学、物理学理论和结构生物学、计算机学和信息科学等学科与药物研究的交叉、渗透与结合日益加强,使药学领域面貌一新, 1、生物药
4、剂学相关知识生物药剂学（biopharmaceutics）是上世纪60年代迅速发展起来的药剂学新分支，主要研究药物及其剂型在体内的吸收、分布、代谢与排泄过程，阐明药物的剂型因素、用 药对象的生物因素与药效三者之间的关系。为正确评价药物制剂质量、设计合理的剂型和制 备工艺以及指导临床合理用药提供科学依据，以确保用药的有效性和安全性。它对指导给药 方案的设计，探讨人体生理及病理状态对药物体内过程的影响，疾病状态时的剂量调整，剂量与药理效应间的相互关系及对药物相互作用的评价等有着重要的作用。生物药剂学的研究内容主要有： （1）剂型因素的研究。研究药物剂型因素和药效之间的关系，这里所指的剂型不仅是指片
5、 剂、注射剂、软膏剂等剂型概念，还包括跟剂型有关的各种因素，如药物的理化性质（粒径、晶 型、溶解度、溶解速度、化学稳定性等）、制剂处方（原料、辅料、附加剂的性质及用量）、制备工艺 （操作条件）及体内相互作用等。 （2）生物因素的研究。研究机体的生物因素（年龄、生物种族、性别、遗传、生理及病理条件 等）与药效之间的关系。 （3）体内吸收机理等的研究。研究药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄的机理对药效的 影响，保证制剂有良好的生物利用度和安全有效。 2、GC-MS技术在生物药剂学及药代动力学研究中的应用2.1色谱联用的发展在色谱联用仪中，气相色谱和质谱联用仪GC-MS是开发最早的色谱联用仪器 。自
6、1957年霍姆斯Holmes JC和莫雷尔 Morrell FA 首次实现气相色谱和质谱联用以后，这一技术得到长足的发展。由于从气相色谱柱分离后的样品呈气态，流动相也是气体 与质谱的进样要求相匹配，最容易将这两种仪器联用，而且气-质联用法综合了气相色谱和质谱的优点弥补了各自的缺陷，因而具有灵敏度高、分析速度快和鉴别能力强的特点，可同时完成待测组分的分离和鉴定，特别适用于多组分混合物中未知组分的定性和定量分析；判断化合物的分子结构；准确地测定化合物的分子量，是目前能够为pg级试样提供结构信息的工具，故可用于测定生物样品和体液中药物和代谢物的痕量分析。对挥发性成分可直接进行定性和定量分析，对不挥发
7、性成分和热不稳定的物质可进行适宜的衍生化再进行分析GC-M法现已广泛用于药物滥用监测、兴奋剂检测、临床疾病诊断、药动学研究等体内药物分析1。在兴奋剂检测中的应用根据国际奥委会医学委员会的要求 体育运动中的兴奋剂检测唯一能用作确认的仪器是 GC-MS 一般兴奋剂检测实验室都以 GC-MS HP5970/71/72/73 做初筛 初筛一般用选择离子检测 SIM 能有较高的灵敏度 初筛有怀疑的样品必须重新进行检测 并用样品与同样条件下比对物全扫描提供的质谱图的一致性 保留时间的一致性对检测物质进行定在兴奋剂检测中的应用根据国际奥委会医学委员会的要求 体育运动中的兴奋剂检测唯一能用作确认的仪器是 GC
8、-MS一般兴奋剂检测实验室都以 GC-MS HP5970/71/72/73 做初筛 初筛一般用选择离子检测 SIM 能有较高的灵敏度 初筛有怀疑的样品必须重新进行检测 并用样品与同样条件下比对物全扫描提供的质谱图的一致性 保留时间的一致性对检测物质进行定代谢的一般规律和对质谱图的分析 在受试者的尿液中 确认检出美保龙原形和 6 种代谢产物 并测定了它们的代谢消除曲线。药物代谢动力学研究的是药物在体内的过程,也就是研究机体对药物的处置过程,以便了解药物在体内的变化规律 ,评价药物的作用,因此药物代谢动力学是药物研究的重要内容。在传统的药物研究过程中,一般是在经过大量临床前研究确定了药物的开发方案
9、后,再对其进行药物代谢动力学和安全性的逐项评价。药物代谢动力学研究实际上是针对 已经确定的药物进行的体内过程的观察。但是,新药研究的统计结果表明,在进人临床前研究的化合物中,仅有很少的化合物成为上市药物而用于临床。导致临床前验机失败的原因主要有动物实验毒性过大约占11%；药效较差占30%；人体副作用过大占10%。药物的吸收（absorption）、分布(distribution)、代谢（metabolism）、排泄（excretion）(简称ADME)性质不佳占39%。也就是说许多化合物被淘汰于其吸收 分布 代谢 排泄等药物性质不理想。因此,在药物设计过程中,早期阶段对药物的吸收、分布、代谢、
10、排泄等药代性质进行评估 ,可以提高成功率,节约研究成本 2。体内药物代谢动力学研究主要是在动物模 型上给予一定剂量的化合物后 ,测定动物体液中化合物的浓度随时间的变化情况,从而得到该化合物的药代参数。例如,药物浓度的达峰时间(Tmax)、药物消除半衰期（t1/2）、分布体积(V)、清除率(CL) 和口服生物利用度(F)等。药物在体内代谢过程的阐明,这些都必须依赖先进的检测技术。现在多采用色谱连用技术对生物样品进行分析。2.2常见色谱联用法随着人们对药物代谢动力学研究的重视,药物代谢动力学的研究进展迅速,在应用方面,不仅在药物的临床前阶段进行了药物代谢研究 ,而且在药物的早期筛选阶段也应用了一些
11、新的药物代谢的方法对药物的代谢特性进行研究。在研究的技术方法方面的进展更为显著,除了灵敏度更高的先进仪器设备大量应用于药物代谢研究 ,一些新的技术方法也不断出现。2.2.1气相色谱-质谙联用法GC-MS由质谱分析仪和色谱分析仪两部分组成 ,结合了各 自的优点,弥补 了各 自的缺陷,因而具有灵敏度高 、分析速度快、鉴别能力强等特点,是超高灵敏度测定的高效离子光学系统 ,既可进行微量物质定量检测 ,同时通过质谱分析进行正确的物质定性分析,能够简便地进行多种化合物的测定。而且可同时完成待测组分的分离和鉴定,特别适用于多组分混合物中未知组分的定性定量分析 、化合物的分子结构判断、化合物分子量测定,是
12、目前能够为pg级试样提供结构信息的工具。故可用于测定生物样品和体液中药物和代谢物的痕量分析。在体内药物分析方面的应用也得到了广泛开展3-4 。2.2.2液相 色谱一质语联用法液相色谱一质谱联用技术是当代最重要的分离和鉴定方法之一。它是以HPLC为分离手段,质谱为检测器的一门综合性分析技术,它集HPLC的高分离能力与质谱的高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体,成为体内药物分析研究 中不可或缺的有效工具。液相色谱质谱联用法由于弥补了传统的GC检测器的不足5。3、Caco-2细胞模型在生物药剂学领域的应用6Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等
13、结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。可以用来进行模拟体内肠转运的实验。在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。细胞亚显微结构研究表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接7。胞饮功能的检测也表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似。由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。 作用：1、研究药物吸收的潜力；2、研究药物转运的机制，包括吸收机制和排除机制；3、研究药物、营养物质、植物性成分的肠
14、道代谢。 判断药物吸收能力的方法：Papp（表观渗透系数） 1、Papp2*10-6属于吸收好的药物，如Testosterone(睾酮):1.0*10-5cm/s Propranolol（普奈洛尔）:2.86*10-5cm/s 2、Papp10-6属于吸收差的药物 如Mannitol(甘露醇):1.0*10-7 cm/s Atenolol（阿替洛尔）:4.55*10-7 cm/s 8-9Caco-2细胞模型在口服药物吸收过程研究中的应用Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态上十分相似,具有相同的细胞极性和紧密连接;存在于小肠中的种种转运系统、代谢酶等在Caco-2细胞中都有相同的存在。Caco
15、-2细胞模型的跨膜转运实验可以用来模拟药物在体内的经小肠上皮吸收过程。Caco-2 在药物开发中的应用主要有: (1)用于药物结构-转运关系的研究;(2)用于药物及制剂处方组成透膜性和粘膜毒性的评价;(3)用于前体药物口服吸收的快速评价;(4)用于吸收过程药物相互作用的预测; (5)用于药物在小肠上皮代谢稳定性的估计;(6)用于揭示小肠上皮吸收的限速因素;(7)用于评价肠腔内PH 值对吸收的影响10。4、微透析技术的应用微透析技术是以透析原理作为基础的在体取样技术, 是在非平衡条件(即流出透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中浓度) 下, 灌注埋藏在组织中微透析探针, 组织中待测
16、化合物沿浓度梯度逆向扩散进入透析液, 被连续不断地带出, 从而达到从活体组织中取样的目的。微透析技术是一种在体取样技术, 它具有以下几个方面显著特点:(1)时间分辩率性, 可连续跟踪体内多种化合物量随时间的变化,(2)空间分辩率性, 取样无需匀桨过程, 可真实代表取样位点目标化合物的浓度,(3)提供不含蛋白质等到大分子物质的游离态小分子化合物,对药物研究具有重要意义,(4)样品因不含蛋白质、酶等大分子物质, 可不经预处理直接用于测定。4.1 微透析采样部位从单一部位向多部位同步、平行采样发展微透析采样技术最早用于神经递质采样中，故脑微透析一直是微透析技术主要应用领域，如脑的黑质、纹状体均是较好的脑采样部位。随着生命科学和信息技术迅猛发展，多部位采样越来越成为微透析技术应用的主流方向。多部位平行、同步采样可以阐明药物作用机制、药物体内分布的特异性、新
