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1、第六章分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization & Blotting Technology,一、分子杂交和印迹技术 （一）分子杂交和印迹技术的基本原理； （二）影响分子杂交的因素； （三）核酸探针 （四）分子杂交和印迹技术的种类及应用,掌握分子杂交及印迹技术的基本原理，分子杂交、探针的概念。 熟悉探针的来源，选择探针的基本原则，寡核苷酸探针的选择要求，探针的同位素标记及非同位素标记的特点及种类。核酸分子杂交种类，Southern Blot、 Northern Blot的基本原理、过程及区别。 了解影响杂交反应的因素，各种杂交条件的选择。,核酸分子杂交 (nucleic
2、acid hybridization ) 分子杂交以DNA的变性和复性为理论基础。DNA在某些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏，由双链变成单链的过程谓之DNA变性。变性DNA的单链重新合成双链的过程为DNA的复性。 分子杂交是不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。,一、分子杂交与印迹技术的基本原理,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,例：变性引起紫外吸收值的改变,DNA的紫
3、外吸收光谱,增色效应：DNA变性，由于解链使更多的共轭双键暴露，使其溶液OD260增高，并与解链程度有一定的比例关系的现象。,目 录,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。,目 录,Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成。 在DNA变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%（一半） 时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度 (melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正比。,G、C含量越高，Tm越大；DNA越长，Tm越大；溶液的 离子强度增
4、高，Tm增加。 在Tm时，有一半的DNA双链被打开,DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应 DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,目 录,变性和复性的应用：,核酸分子杂交(hybridization) 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化
5、双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,复性,RNA,DNA,二、影响杂交的因素,核酸分子的浓度和长度 浓度大，复性快；分子量大，复性慢 温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应,三、核酸探针,*探针 (probe)概念 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 探针的种类 基因组DNA探针；cDNA 探针； RNA探针；寡核苷酸探针。,基因组D
6、NA探针： 为某一基因的全部或部分序列； 制备：基因组文库选取某一基因，与质粒或噬菌 体连接，基因克隆后酶切获得。 PCR扩增基因组DNA片段 注意：真核基因使用编码序列（外显子）作为探针，避免使用内含子和其它非编码序列。 DNA探针的优点： 制备方法简单；相对RNA而言DNA探针不易降解； DNA探针的标记方法较成熟,cDNA探针： cDNA上指点互补mRNA的DNA分子 优点：不含内含子和高度重复序列 但不易获得. RNA探针单链RNA分子 优点:无互补双链的竟争,杂交效率高,稳定性高 不存在重复序列,非特异性杂交较少 可用RNase将未杂交的探针水解,减少本底干扰. 但：易降解；标记复杂
7、 应用:检测DNA、mRNA；观察基因转录及真核基因的表达调控,寡核苷酸探针 优点： 根据需要合成相应序列，可避免天然探针存在的高度重复序列带来的不利影响 链短（1050bp)、复杂性低、分子量小，与点量靶位点完全杂交所需时间短（短于克隆探针） 能识别序列内1个碱基的变化，明显降低杂交的Tm值 可大量合成，价格低、可进行酶学或化学方法进行非放射性标记 设计原则 长度：1050bp（过长，合成困难、杂交时间长；过短， 特异性差） G+C含量：4060% 探针分子内部无互补序列，否则会引起发夹结构 避免同一碱基重复出现多于4个 一旦选定某一寡核苷酸序列，需与已知的各种基因序列进行同源性比较，若与非
8、靶基因序列有70%以上的同源性，应重新设计,DNA探针通常为400500个碱基，在探针标记过程中可调整DNA探针的长度。 RNA探针的长度 相对就不那么易控制,探针的长度,探针太短，可与多个位点杂交降低特异性 探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性。 F=(1/4)L2N F值：探针和靶序列杂交的可能频率 L：探针的核苷酸数目（长度） N：靶序列的复杂性,DNA和RNA探针,寡核苷酸探针,探针的标记,标记物 核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等 一个理想的探针标记物： 具有高度灵敏性 标记物与探针结合后不影响杂交时的碱基配对 检
9、测方法有高灵敏性、高特异性、假阳性低、环境污染少、价格低 若用酶学方法标记时，对酶的Km值影响小，也不影响下一步酶促反应,可准确定量，灵敏度高可检测固相介质上10fg(10-15g)的DNA 本底低，易除去旧探针重新杂交新探针 特异性高, 对杂交无影响,放射性标记-应用最多的一类,优点,缺点,短半衰期的探针要求临时制备, 随用随标 放射性递减使探针降解 放射性对人体有害,需防护 费用贵,无放射性，对人体的危害小 探针性质稳定，可供长时间内持续使用 检测过程快，可同时进行不同标记探针的杂交 本底较低,非放射性标记,优点,缺点,灵敏度和特异性不如放射性探针 杂交条件受到报告基团的限制 重新杂交新探
10、针较困难,生物素 地高辛 荧光素：FITC，罗丹明 化学发光物：如ECL 光密度或电子密度标记物 碱性磷酸酶(ALP) 辣根过氧化物酶(HRP),非放射性标记物种类,探针标记方法 缺口平移法(nick translation) 随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物 PCR标记法 末端标记法 探针纯化,四、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白质的印迹分析 (Western blott
11、ing) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,（四）其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip),目 录,(一) Southern 印迹杂交,1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。,Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤,待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(N
12、C)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测,Southern印迹杂交法,10SSC 转移缓冲液,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸,纸巾,玻璃板,重物,与探针同源杂交的基因DNA片段,基因组DNA,DNA酶切片段,NC或尼龙膜,NC膜或尼龙膜,(二) Northern 印迹杂交(Northern bloting),检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性,Northern印迹杂交,RNA的提取,由于RNase具有活性高、不易灭活的特点，在提取中必须防止RN
13、ase对RNA 的降解作用。细胞裂解液异硫氰酸胍可以抑制此酶活性。,RNA变性电泳,电泳前应加变性剂，如甲醛、乙二醛等使RNA二级结构解体，才能使RNA 严格按相对分子质量大小分离。变性剂还可促进RNA与硝酸纤维素膜结合。,印迹转移,若待测的RNA片段较大，可预先将凝胶置于0.05mol/L NaOH中浸泡20 min， 以水解成较小的片段，再用20 xSSC浸泡45 min，以加快RNA的印迹转移。,预杂交,杂交,洗膜,放射自显影或化学显色,(三)Western 杂交印迹法(Western bloting),检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴
14、定及定量的方法 主要步骤： 蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 蛋白质的电转移：NC膜 靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应,Western印迹杂交,三种印迹技术的比较,放射自显影照片,目 录,(四)原位杂交(in situ hybridization),将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,核酸原位杂交的基本步骤,细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测,DNA点阵,目 录,DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。,基因芯片,基因芯片(gene chip),目 录,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片(protein chip),
