粪便钙卫蛋白检测试剂盒说明书-中文.pdf

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1、粪便钙卫蛋白检测试剂盒粪便钙卫蛋白检测试剂盒 （酶联免疫法）（酶联免疫法） 货号货号 EK-CAL 96T EK-CAL2 192T 用途：用途： 瑞士 BHLMANN 公司生产的粪便钙卫蛋白检测试剂 盒（酶联免疫法）用于定量检测人粪便中的钙卫蛋白 （MRP8/14; S100A8/S100A9） 。 产品原理产品原理 本试剂盒应用双抗体夹心法，基于不同位点的两种单 克隆抗-人钙卫蛋白抗体。标准品、质控品和稀释后的待测 样本加入到具有高亲和力的单克隆抗-人钙卫蛋白抗体包被 的微孔板微孔内。 在第一次孵育步骤中， 样本中钙卫蛋白被 固相抗体捕获。 加入酶联物后第二次孵育时， 形成以下复合 体：捕

2、获抗体-人钙卫蛋白-酶标抗体结合物。接着加入 TMB 底物进行显色， 加入酸液终止液终止显色反应， 溶液变成黄 色。 黄色亮度与样本中钙卫蛋白浓度成正比。 最后在酶标仪 450nm 波长处测量吸光度。 做出标准品浓度对相应 OD 值的 标准曲线，在其上计算出样本浓度。 试剂成分：试剂成分： 试剂试剂 量量 编号编号 说明说明 提取缓冲液 3 瓶， 125ml B-CAL-EX 直接使用 微孔板 （预 包被钙卫蛋 白单克隆抗 体） 12*8 孔 B-CAL-MP 直接使用 封板膜 3 张 浓缩洗涤液 （10X） 含防腐剂 1 瓶， 100ml B-CAL-WB 用 900ml 去离子水 稀释 孵

3、育缓冲液 含防腐剂 2 瓶， 125ml B-CAL-IB 直接使用 标准品 1,2 5 支，1ml B-CAL-CASET 直接使用 质控品 高 值/低值 2 支，1ml B-CAL-CONSET 直接使用 酶联物 1 支，12ml B-CAL-EL 直接使用 TMB 底物 B-TMB12 直接使用 终止液 B-STS12 直接使用 1 钙卫蛋白标准品从 A 到 E 的实际浓度为 4,12,40,120 和 240ng/ml。 使用低范围检测程序时 （样本用提取缓冲液 1:50 倍稀释，提取物再用孵育缓冲液 1:50 倍稀释，共稀释 250 倍） 标准品钙卫蛋白分析浓度分别为10,30,10

4、0,300,600ug/g。 如使用扩展范围检测程序时（样本用提取缓冲液 1:50 倍稀 释，提取物再用孵育缓冲液 1:150 倍稀释，共稀释 750 倍） 标准品钙卫蛋白分析浓度分别为 30,90,300,900,1800ug/g。 2 标准品和质控品在检测时直接使用，无需稀释。 根据需要可由供应商提供的试剂根据需要可由供应商提供的试剂 粪便提取设备粪便提取设备 Smart-Prep 50 支 B-CAL-RD Schebo Quick- Prep 50 支 B-CAL-SOFI 1.3ml，直接使用 试剂储存条件和效期试剂储存条件和效期 未开封试剂未开封试剂 2-8 度储存，失效期标注在试

5、剂盒标签上，不要使用超过失 效期的试剂盒 已开封试剂已开封试剂 提取缓冲液提取缓冲液 2-8 度储存，直至失效期 微孔板微孔板 未使用的板条立即重新放回装有干燥 剂的铝箔袋中，并封上自封口。 2-8 度储存，直至失效期 已稀释的洗涤已稀释的洗涤 液液 2-8 度储存，最多 6 个月 孵育缓冲液孵育缓冲液 2-8 度储存，直至失效期 标准品标准品 质控品质控品 酶联物酶联物 TMB 底物底物 终止液终止液 需要但没提供的材料需要但没提供的材料 抽提程序抽提程序 10ul 一次性接种环(Sarstedt: 86.1562.010) 15ml 带帽聚丙烯管(Sarstedt: 62.554.502)

6、 层流工作站 多管旋涡混合器 精密天平(10 - 150 毫克) 小型离心机（3000 g） ELISA 程序程序 10、100 及 1000ul 移液器及配套吸嘴 用于样本稀释的一次性试管 用于稀释洗涤液的 1000ml 量筒 用于洗板的洗板机或塑料挤瓶 吸水纸 酶标仪（450nm） 注意事项：注意事项： 安全措施安全措施 试剂盒内的微孔板、 标准品和校准品还有人源性成分，尽管 已经过检测，HBV 表面抗原、HCV 以及 HIV1/2 均为阴性， 但仍然应视为有潜在传染性的物质对待， 遵守实验室规程并 采取适当的防护措施。 底物和终止液：TMB 底物还有联苯胺、H2O2 以及二甲基甲 酰胺，

7、终止液含有硫酸（0.25M） ，这些试剂都会刺激眼睛、 皮肤和黏膜， 避免试剂接触眼睛、 皮肤并穿着合适的防护服、 手套、和眼镜。如试剂接触到眼睛和皮肤，应立即用清水冲 洗。 未使用的溶液必须按当地法规进行处理。 技术措施技术措施 试剂盒组件试剂盒组件 不要使用超过标签上所示有效期的试剂盒 不要混合不同批号的试剂 避免试剂、样本和孔间的交叉污染 使用前将试剂恢复到室温并混匀 微孔板不可重复利用 提取提取 为了获得准确的定量结果， 必须将加入到提取缓冲液中的已 称重的所有粪便样本变成匀浆。要避免样本残留在管帽处。 样本提取时最短需要 5 分钟可获得有浑浊的液体， 延长离心 时间可以减少或消除浊度

8、，但试验表明浊度对 ELISA 的定量 结果无影响。 ELISA 过程过程 为获取可重复的准确结果， 清洗步骤是必不可少的。洗涤液 加入到每个检测孔后，每次必须至少孵育 20 秒，洗板次数 也要按照要求进行。 如使用自动洗板机，强烈建议使用“板模式” ，可缩短孵育 时间。 检测板震荡参数：400-600 转/分（10HZ） 。 建议标准品、 校准品和标本做复孔， 每次实验都必须使用本 次新做的标准曲线。 如果某个未知样本的检测到的浓度比最高的标准品浓度还 要高， 则需要将这个未知样本进一步稀释并重新检测，由此 产生的稀释系数必须体现到计算结果中。 样本采集和储存样本采集和储存 提取程序需要的粪

9、便样本量为 50-100mg 将粪便样本放入试管中，在 2-8 度可储存 6 天 粪便样本冷冻后，钙卫蛋白的浓度会略有上升。因此，如需 长期保持， 建议将提取物储存于-20 度， 可保存至少 4 个月。 重要提示重要提示：样本收集装置不可含有其它生物或化学成分。 试验过程试验过程 提取提取 标准提取程序标准提取程序 1、 将接种环和贴上标签的空 PE 管称重 2、 用接种环将 50-100mg 的粪便样本加入到 PE 管内 3、 估算样本的净重 4、 向管中加入提取缓冲液 （样本净重的 49 倍） ， 并盖紧管 子。 粪便重量（mg） 提取液体积（ml） 50 2.5 55 2.7 60 2.

10、9 65 3.2 70 3.4 75 3.7 80 3.9 85 4.2 90 4.4 95 4.7 100 4.9 5、 将样本管放入多孔漩涡混匀器，用最高速充分震荡 30 分钟，使样本变成匀浆。 6、 将匀浆转移到 2ml 的微量离心管， 放入微型离心机， 用 3000 xg 离心 5 分钟。 7、 将上清转移到干净的，贴有标签的管内，可直接用于后 续的 ELISA 试验或放入-20 度或以下储存 4 个月以上。 使用粪便提取装置进行提取使用粪便提取装置进行提取 粪便提取装置的操作请参见各装置的说明书。 1、 罗氏粪便提取装置（产品代码 10745804 322）或 BHLMANN Sma

11、rt-Prep (产品代码: B-CAL-RD)： 提取时间 （漩涡时间）可缩短到 1 分钟。 2、 ScheBoQuick-PrepTM（产品代码： B-CAL-SO50） ：提 取管已预装提取缓冲液，提取时间（漩涡时间）约 10 分钟。 提取后， 用 3000 xg 离心 5 分钟， 或先将匀浆转移 2mlPE 管后再用 3000 xg 离心 5 分钟。 将上清转移到干净的， 贴有标签的管内， 可直接用于后 续的 ELISA 试验或放入-20 度或以下储存 4 个月以上。 ELISA 过程过程 根据样本中钙卫蛋白的预期浓度，试验可选择两种 不同的程序：低浓度范围程序低浓度范围程序和扩充范围

12、程序扩充范围程序。样 本浓度不超过 600ug/g，选择低范围浓度程序，将 样本 1:50 倍稀释，工作范围 10-600ug/g；如果样本 浓度超过 600ug/g，选择扩充范围浓度程序，将样 本 1:150 倍稀释，工作范围 30-1800ug/g。 低范围低范围 ELISA 程序程序 工作范围工作范围 10-600ug/g 使用前将试剂平衡到 18-28 度 1、 将粪便提取物用孵育缓冲液 1：50 倍倍稀释（例如 20ul 提取物加 980ul 孵育缓冲液）并混匀，并保证在 18-28 度平衡至少 5 分钟再进行步骤 4C 的操作。 2、 根据标准品、 校准品和样本的数目取出足够的板条

13、，将 剩余板条立即放入铝箔袋中并密封后放入冰箱冷藏。 3、 用洗涤液洗涤包被孔两次两次，每次每孔 300ul，甩干并在 在吸水纸上轻轻拍干。 重要提示重要提示： 必须确保洗涤液每次加入到检测孔后至少孵 育 20 秒再进行下一步操作。 4a、第 1 孔加入 100ul 孵育缓冲液（空白） ，将标准品 A-E 各取 100ul 依次加入到各自孔内。 4b、取低、高值质控品各 100ul 依次加入到各自孔中。 4c、将已 1:50 倍稀释的样本依次加入到后续孔内。 5、 用封板膜将检测板密封，放在 400-600 转/分钟的水平 振荡器上，于 18-28 度孵育 30（+5）分钟。 6、 移除封板膜

14、， 甩干并用洗涤液洗板三次三次 （每孔至少 300ul 洗涤液） ，甩干并在吸水纸上轻轻拍干。 7、 每孔加入 100ul 酶结合物。 8、 用封板膜将检测板密封，放在 400-600 转/分钟的水平 振荡器上，于 18-28 度孵育 30（5）分钟。 9、 移除封板膜， 甩干并用洗涤液洗板五次五次 （每孔至少 300ul 洗涤液） ，甩干并在吸水纸上轻轻拍干。 重要提示：确认 TMB 底物已平衡到 18-28 度。 10、 每孔加入 100ulTMB 底物。 11、 用封板膜将检测板密封，放在 400-600 转/分钟的水平 振荡器上，于 18-28 度避光避光孵育 15（2）分钟。 12、

15、 每孔加入 100ul 终止液，用吸嘴移除孔内气泡，并在 30 分钟内进行第 13 步操作。 13、 将检测板用酶标仪读数（波长 450nm） 结果结果 工作范围工作范围 10-600ug/g 标准曲线：检测结果包含标准品和空白孔在 450nm 的吸光 度（OD） ，将标准品的吸光度减去空白的 OD，用半对数坐 标纸（lin/log）绘制吸光度（Y 轴）和标准品钙卫蛋白浓度 （X 轴） ，得到最佳拟合曲线和采用四参数拟合方式计算标 准曲线。 标本和质控品：将样本和质控品在 450nm 的吸光度将去空 白 OD，再根据标准曲线可求出标本或质控品的浓度。 使用低范围 ELISA 程序时，标准品的分析浓度为 10,30,100,300,600ug/g。 如果额外稀释， 必须将结果乘以稀释因子才能得到最终结果。 性能特点性能特点 试剂盒的性能特点根据重复试验确定 工作范围 10-600ug/g 批内精密性：4.7% 批间精密性 15% 检测极限：10 ug/g 检出限：10 ug/g 稀释线性：103% 交叉反应性：0.1% 扩充范围扩充范围 ELISA 检测程序检测程序 工作范围工作范围 30-1800ug/g 使用前将试剂平衡到