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1、生化分离技术复习重点1. 生化分离，生化分离技术的基本步骤 生物分离与纯化的目的是从微生物发酵液，酶反应产物，动植物细胞培养和生物体本身分离并纯化对人类有用的，符合质量要求的各种生物药物和生物制品。来源：（1）动物脏器 （2）血液，分泌物和其它代谢物（3）海洋生物（4）植物（5）微生物特点：（1）目的产物浓度低，纯化难度大（2）活性物质性质不稳定，操作过程容易失活（3）生物材料中生化组分数量大，分离困难 （4）生物材料易变质，保存困难（5）生物产品的质量标准高基本步骤：原料的选取和预处理，分离提取，精制和成品的制作2. 吸附技术概念：是指在一定条件下，将待分离的料液（或气体）通入适当的吸附剂中
2、，利用吸附剂对料液（或气体）中某一组分具有选择吸附的能力，使该祖坟富集在吸附剂表面，然后再用适当的洗脱机将吸附的组分从吸附剂上解吸下来的一种分离技术吸附剂类型：（1）物理吸附（范德华力）（2）化学吸附（电子转移）（3）交换吸附（离子交换）常用的吸附剂：一类有机吸附剂，如活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等；另一类是无机吸附剂，如氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙氢氧化铝等。活性炭吸附规律：对具有极性基团的化合物吸附力较大；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对相对分子质量大的化合物的吸附力大于相对分子质量小的化合物。影响吸附的因素：吸附剂的性质；吸附物的性质；吸附条件（温度、PH、盐的浓度）
3、、溶剂的影响。3.膜分离技术概念：指物质在推动力作用下由于传递速度不同而得到分离的过程。特点：易于操作；成本低、寿命长；高效；常温下操作无相态的变化，分离精度高，没有二次污染；膜材质的价格高；操作过程中膜面容易被污染；膜的耐药性，耐溶性，耐热性能有限。类型：渗析；电渗析；微滤；超滤；反渗透；纳滤；气体分离微孔滤膜清洗和再生方法：将滤膜平放于清洁盛器内，用60左右的蒸馏水浸泡，使全部湿润，数小时候（约4小时以）倾去水，再用上法浸泡12小时，使用前再用适量温蒸馏水清洗一次。微孔滤过膜截留粒子的范围：0.110m的粒子。4.液膜分离技术概念：是一种以液膜为分离介质，以浓度差为推动力的分离操作，是属于
4、液液系统的传质分离过程。组成：膜溶剂；表面活性剂；流动载体；膜增强剂。分类：乳状液膜；支撑液膜。液膜分离步骤：制备液膜；液膜萃取；澄清分离；破乳。影响因素：液膜乳液成分的影响；乳水比；连续的PH；搅拌速度的影响；料液的浓度和酸度的影响；操作温度的影响；接触时间。应用：分离氨基酸；提取抗生素；提取生物碱；提取蛋白质；分离有机酸；应用酶反应和酶萃取；液膜包裹。5.盐析基本原理：在高浓度中性盐存在的情况下，蛋白质（或酶）等生物大分子在水溶液中的溶解度降低并沉淀出的现象称为盐析。影响盐析的因素：盐饱和度；蛋白质浓度；PH值；温度盐加入方式：（1）加硫酸铵的饱和溶液;(2)直接加固体硫酸铵6.等电点沉淀
5、法基本原理：两性生化物质在溶液PH处于等电点时，分子表面电荷为零，分子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉淀。等电点概念：蛋白质或两性电解质(如氨基酸)所带净电荷为零时溶液的pH，此时蛋白质或两性电解质在电场中的迁移率为零。7.结晶概念：溶质呈晶态从溶液中析出的过程称为结晶。过程：过饱和溶液的形成；晶核的生成；晶体的生长。影响结晶因素：溶液浓度；样品纯度；溶剂；PH；温度；时间。方法：盐析法；加饱和盐溶液；透析法；有机溶剂（直接加有机溶剂或者利用挥发性溶剂蒸发结晶）；等电点；其它（温度差，加入金属离子）等。8.有机沉淀法原理：向蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量亲水性
6、的有机溶剂，能显著降低蛋白质等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。常用有机溶剂：乙醇、丙酮、甲醇等。9.固相析出分离技术主要有：结晶法、盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法。10.离子交换法概念：是应用离子交换剂作为吸附剂，通过静电引力将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上，然后用合适的洗脱机将吸附物从离子交换剂上洗脱下来，从而达到分离、浓缩、纯化的目的。常用离子交换剂：人工高聚物作载体的离子交换树脂；多糖作载体的多糖基离子交换剂。分类；一.按树脂骨架的主要成分分：（1）聚苯乙烯型树脂（2）聚苯烯酸型树脂（3）多乙烯多氨环氧氯苯烷树脂（4）酚醛树脂 二.按骨架的物理结构来分：（1）凝胶型树脂
7、（2）大网格树脂（3）均孔树脂 三.按活性基团分类：阳离子交换树脂：（1）强酸性阳离子交换树脂（磺酸基团和次甲酸磺酸基团）（2）弱酸性阳离子交换树脂（羧基和酚羟基）阴离子交换树脂:（1）强碱性阴离子交换树脂（季铵基团）（2）弱碱性阴离子交换树脂（伯胺基。仲胺基）离子交换树脂的理化性能：交联度；交换容量；粒度和形状；滴定曲线；稳定性；膨胀性。影响离子交换树脂选择因素：离子化合价；离子的水化半径；溶液浓度；离子强度；溶液的PH；有机溶剂的影响；树脂的物理结构的影响；树脂与离子间的辅助力影响离子交换速度的因素：树脂粒度；树脂的交联度；溶液流速；温度；离子的大小；离子的化合价；离子浓度。离子交换技术的
8、一般流程：原料液的预处理原料液与离子交换树脂的充分接触淋洗交换树脂把离子交换树脂上的有用物质解吸并洗脱下来离子交换树脂的再生。11.层析柱装柱的操作方法：首先选好柱子，一般柱子的直径与长度比为1:1050；凝胶柱可以选1:100200，同时将柱子洗涤干净。将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N1N）、碱（0.5N1N）、盐（0.5M1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢
9、地倒入柱中，使其沉降约3cm高。打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。）最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有23cm高的缓冲液，同时关闭出水口。12.亲和层析原理：亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。影响吸附剂亲和力的因素：配基浓度；空间障碍；配基与载体的结合位点；载体孔径。13.疏水作用层析概念：固定相由非极
10、性物质(如烃类、苯基等)组成的层析。非极性分子间或分子的非极性基团间具有吸引力，不同分子的非极性基团与固定相非极性物质结合的强弱不同，从而达到分离。多用于蛋白质分析和分离。原理：蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。14.过滤概念：在推动力或者其他外力作用下悬浮液（或含固体颗粒发热气体）中的液体（或气体）透过介质，固体颗粒及其物质被过滤介质截留，从而使固体及其他物质与液体（或气体）分离的操作。原理：利用物质的溶解性差异
11、，将液体和不溶于液体的固体分离开来的一种方法类型：（1）常规过滤（2）错流过滤15.助滤剂 滤饼作用助滤剂原理：通过加入助滤剂改变进入滤池之前的颗粒或滤料表面性质、电性与尺寸。改变滤料表面性质可提高颗粒向滤料迁移速度与黏附效率；改变进入滤池悬浮颗粒的表面性质与尺寸可提高颗粒黏附效率。按照该机理形成的聚合物颗粒絮体，使颗粒和黏附作用都得到加强。助滤剂的主要种类有：聚合无机高分子（如聚合氯化铝、聚合硫酸铝）合成有机高分子（如聚丙烯酰胺、HAC阳离子絮凝剂）天然有机高分子（如骨胶、海藻酸钠）氧化剂（如氯、臭氧、二氧化氯等）。助滤剂使用方法：（1）在过滤之前先在过滤介质表面预涂一层助滤剂；（2）助滤剂
12、按一定比例均匀加入待过滤的料液中。滤饼：过滤介质一般有一定孔径的纱布或不锈钢网。过滤介质一般是形成滤饼用的。真正起到过滤作用的是滤饼。滤饼的孔隙较过滤介质小。截留能力大。所以，在实验时一般将头一定体积的滤液重新过滤。过滤介质、滤饼都有一定的过滤阻力。过滤介质阻力是不变的。而随着过滤的进行，滤饼不断变厚。阻力不断增加。过滤速度不断减小16.提取：通过溶剂(如乙醇)处理、蒸馏、脱水、经受压力或离心力作用，或通过其他化学或机械工艺过程从物质中制取(如组成成分或汁液)。谓经过提炼而取得。17.精制：从一种物质中把不需要的成分除去 18.萃取：利用溶质在互不相容的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或
13、浓缩的技术。萃取选取的原因：（1）萃取剂分子至少有一个萃取功能基（2）萃取剂分子中必须有相当长的链烃或芳烃（3）选择性好、萃取容量大、化学和辐射稳定性强、容易与原料液分层、操作安全等。影响因素：（1）PH，温度盐析（2）有机溶剂的选择（3）带溶剂（4）乳化和去乳化19.细胞破碎常用的技术：（1）高压匀浆法（2）高速珠磨法（3）超声波法（4）化学法（5）酶解法（6）渗透压冲击法（7）冻结-融化法（8）干燥法常用的溶酶：溶菌酶、透明质酸酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等。20.高压匀浆法的原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，几句释放到低压环境，
14、从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎影响因素：压力、循环操作次数和温度21.化学渗透法破碎细胞的特点：速度低，效率差，且化学或生化试剂的添加形成新的污染，但化学渗透法选择性高，胞内产物的总释放率低，可有效抑制核酸的释放，料液粘度小，有利于后处理。22.珠磨法破碎细胞的影响因素：搅拌速度、料液的循环速度、细胞悬浮液的浓度、珠粒大小和数量、温度等。23.发酵液预处理降低液体黏度常用的方法：（1）加热（2）凝聚和絮凝（3）变性沉淀（4）调节PH24.加入电解质凝聚剂的目的 发酵液中的细胞，菌体或蛋白质等胶体粒子ide表面都带有同种电荷，使得这些胶体粒子之间相互排斥，保持一定距离而不互相凝聚。另外，这
15、些胶体粒子和水有高度的亲和性，其表面很容易吸住水分，形成一层水膜，从而使胶体粒子呈分散状态。在发酵液中加入电解质，就能中和胶体粒子的电性，夺取胶体粒子表面的水分子，破坏其表面的水膜，从而使胶体粒子能直接碰撞而聚集起来。25.絮凝 絮凝的主要影响因素概念：是指使用絮凝剂，在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。原理：絮凝剂一般为高分子聚合物，具有长链线状结构，容易溶于水，其相对分子质量高达数万至1000万以上，在长的链节上含有相当多的活性功能团。絮凝剂的功能团能强烈地吸附在胶粒的表面，由于一个高分子絮凝剂的长链节上含有相当多的活性功能团，所以一个絮凝剂分子可分别吸附在不同颗粒的表面，从而产生架桥链接。絮凝的影响因素：主要是絮凝剂的相对分子质量和种类、絮凝剂用量、溶液的PH、搅拌速度和时间等。26.干燥过程、常用的干燥方法和设备完整的干燥工艺过程：是由加热系统、原料供给系统、干燥系统、除尘系统、气流输送系统和控制系统组成。可分为两个阶段：恒速干燥和降速干燥。常用的干燥方法：常压干燥、减压干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。常用设备：厢式干燥器、真空干燥器、冷冻干燥器、管式气流干燥器、沸腾干燥器、喷雾干燥器等。27.常用的固液分离方法有：过滤、沉降和离心分离。28.浸取技术，影响因素概念：用溶剂浸渍固体混合物以分离可溶组分及残渣的单元操作。
