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1、学习情境一细菌发酵制药,发 酵 制 药,子学习情境1.1天冬酰胺酶发酵,天冬酰胺酶生产的工艺流程,任务1 菌种保藏任务2 菌种复壮任务3 种子扩大培养任务4 发酵罐的使用和维护任务5 发酵控制、分离纯化及活性测定,子学习情境1 天冬酰胺酶发酵,任务1 菌种保藏,二、菌种保藏的原理,挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。 菌种的保藏主要是依据微生物的生理、生化特性，人工创造条件使微生物代谢活动处于不活泼状态。利用微生物的孢子、芽孢及营养体，给以不适合其萌发、生长、繁殖的条件，即低温、干燥、缺氧、缺营
2、养等手段来达到菌种保藏的目的。,三、菌种的保藏方法,斜面保藏法 沙土保藏法 冷冻真空干燥保藏法 试管熔封保藏法 矿油保存法,（一）斜面保藏法,1、贴标签：将注有菌株名称和接种日期的标签贴在试管斜面正上方。 2、接种：将待藏菌种用些面接种法移种至标明菌名的相应试管斜面上。 3、培养：细菌置37恒温培养1524h，酵母菌置2830恒温培养3660h，放线菌和丝状真菌置28培养47d。 4、收藏：为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎或用熔化的固体石蜡熔封棉塞后置4冰箱保存。保存温度不宜太低，否则会因结冰脱水而加速菌种的死亡。,斜面菌种,（二）沙土管或硅胶管保藏法,1、处理沙土：取河沙经60目
3、筛子过筛以除去大的颗粒，用10%HCL浸泡（用量以浸没沙面为度）24h（或煮沸30min）以除去有机质，然后倒去盐酸，用流水冲洗至中性，烘干或晒干备用。另取非耕作层瘦黄土（不含有机质）风干、粉碎，用100120目的筛子过筛备用。 2、装沙土管：将沙与土按2：1或4：1（W/W）比例混合均匀，装入试管（10mm100 mm）中，装置约1cm高，加棉塞后用高压蒸汽灭菌（121灭菌30min）。灭菌后取少许置于牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在合适的温度下培养一段时间确证无菌生长才能使用。 3、制备菌液：吸3ml无菌水至斜面菌种管内，用接种环轻轻搅动，洗一下孢子制成孢子悬液。 4、加孢子液：吸取上述孢
4、子液0.10.5ml于每一沙土管中，加入量以湿润沙土达2/3高度为宜。 5、干燥：将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5（或变色硅胶）做干燥剂，再用真空泵抽气24h以加速干燥。 6、收藏：沙土管可选择下列方法之一。保藏于干燥器中。将沙土管取出，管口用火焰熔封后保藏。将沙土管装入含CaCl2等干燥剂的大试管内，塞上橡皮塞并用蜡封管口，置于4冰箱中保藏。 7、恢复培养：使用时挑少量混有孢子的沙土接种于斜面培养基上即可。沙土管仍可原法继续保藏。,（三）冷冻真空干燥保藏法,分支管再与麦氏真空计和冷凝管相连。冷凝管的另一端连接在真空泵上。 置冷凝管于盛有干冰（固体CO2）的广口保温瓶中，
5、使安瓿管中抽出的水汽进入冷凝管内立刻冻结。 将安瓿管的下半部也埋入干冰中，使管内物质骤然冷却。约10min，管内物质已全部冻结，开动真空泵30min后，将安瓿管移入-15的冰盐水中，继续开动真空泵抽气1h，然后将安瓿管置于室温中，再抽气30min。 此时管内物质已全部干燥，样品呈疏松状。用微型煤气灯在真空状态下，熔封安瓿管的颈部。将制好的冷冻菌种管置于4冰箱中保藏。,先将牛奶煮沸后冷却，去掉上面的一层脂肪。反复三次后用脱脂棉过滤，或者将牛奶在3000r/min的离心机中离心数分钟，除去表面脂肪后，在50kPa压力下灭菌30min。然后用牛奶洗下在斜面上长好的菌体，制成菌悬液，装入安瓿管中约0.
6、1ml，塞上棉塞，用橡皮管将安瓿管连接在分支管上（见图1-1）,图1-1 冷冻干燥封管装置简图 1、安瓿管 2、干冰容器 3、接真空计 4、接真空泵 5、冷凝管,（四）试管熔封（密封）保藏法,试管熔封法的一般操作如下： 用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养2448小时后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室温和冰箱下保存。 使用时，用砂轮在管口划一圈，并在乙醇灯下火焰灭菌后敲开管口即可转接到另一斜面上，由于试管经熔封后，可防止培养基水分蒸发，又可减缓细菌的代谢速度，并能防止杂菌污染。 密封法保藏法 将需保藏菌种按无菌操作要求接种至固体培养基（细菌采用肉汤琼脂、
7、酵母采用蔡氏培养基、放线菌采用高氏号培养基）上，经适温培养后，（细菌d，孢芽菌、放线菌d，酵母菌d）塞紧棉花塞，放在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林。盖紧后使之与真空泵相连接，开动真空泵抽真空30rain至h（此时真空度约为640），关闭密封口，拔出胶塞，置于室温下保存，待使用时，打开盖，取出菌种，接种至培养基上即可 。,（五）矿油保存法,菌种在琼脂斜面上或在半固体琼脂试管中生长后，在试管中再加入无菌液体石蜡，使覆盖在培养基上面，这样就使菌种和培养基与外界空气隔绝，并可防止培养基水分蒸发，管口可用固体石蜡封口，放置低温保存，至少可以保存六个月至一年）。,表1-1 菌种保藏各种方法比较表,表1-
8、2微生物菌种制备、保藏和使用记录表,表1-3 菌种接收记录表,任务2菌种复壮,菌种合理传代方法之一,一、菌种的衰退、复壮概念,1.衰退（degeneration） ：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 衰退的原因：基因突变，分离现象。 常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降。 2、菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等
9、方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。,二、菌种复壮的主要方法,纯种分离法 宿主体内复壮法 淘汰法 遗传育种法 菌种保藏方法,纯种分离法,平板涂布方法,平板划线方法,三、菌种复壮操作步骤,1、菌悬液的制备。用无菌生理盐水或缓冲液将斜面菌体洗下制成菌悬液。经一定浓度稀释后在平板上进行菌落计数。 2、平板分离。根据计数结果，定量稀释后制成菌浓度为每毫升50-200个的菌悬液，取0.1毫升注入平皿，再倒
10、入适量培养基，摇匀，制成混菌平板，培养后长出 分离的单菌落。 3、纯培养。选取分离培养后长出的各型单菌落，接种斜面后培养。 4、初筛。将成熟的斜面菌种对应接入发酵瓶，摇床发酵一段时间后测定各菌落生产性能。 5、复筛。挑选初筛中高单位菌株的5%20%进行摇瓶复试，最好使用母瓶与发酵瓶二级发酵，重复35次后分析确定产量水平。初、复筛都需以正常生产菌种作对照，复筛出的菌株产量应比对照菌株提高5%以上，并经糖、氨代谢检验，合格后在生产罐上试验。 6、菌种保藏。将复筛后得到的高单位菌株制成沙土管、冷冻管或用其他方法保藏。,任务3 种子扩大培养,种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的
11、生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件： （1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； （2）生理形状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。,一、种子的制备过程,种子扩大培养流程图,1、实验室细菌种子的制备,细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37。细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养则需要510天。 (1)菌种培养：采取大肠杆菌ASl-375。普通牛
12、肉培养基，接种后于37培养24h。(2)种子培养。16%玉米浆，接种量1%一1.5%，37温度，通气搅拌培养48h。 其过程如下： 试管三角瓶摇床种子罐,液体培养法（三角瓶摇床振荡或转式培养）,2、生产车间种子制备,种子罐的作用： 主要是使菌体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于： 菌种生长特性、菌体繁殖速度； 所采用发酵罐的容积。 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶种子罐发酵罐,3、确定种子罐级数需注意的问题,种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会 种子级数太少
13、，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。,二、种子质量的控制,(一)影响孢子质量的因素及控制 影响孢子质量的因素通常有：培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等。 1 、培养基 （1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用； （2）严格控制灭菌后培养基的质量； （3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间； （4）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。,2、种龄与接种量 种
14、龄：种子培养时间。 一般选择对数期，缩短发酵周期。 接种量：移入的种子液体积与接种后培养液体积比。 多数抗生素的接种量在7%-15%，有时20-25%。依据具 体的发酵类型和工艺条件而定。 3、温度： 温度直接影响生长和酶的合成；最适温度。,4、pH值：对微生物有明显的影响 各种微生物都有生长的最适pH。培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。 调节方法 (1) 酸碱溶液中和 (2) 缓冲溶液 (3) 生理缓冲剂,5、通气搅拌搅拌： 促进氧的溶解，营养物质与代谢产物的分散。 通气： 通气量的多少以溶解氧来衡定。,6、泡沫 危害： 影响微生物对氧的吸收。 消泡方法： （1） 消泡剂：天然动植物油
15、、石油化工矿物油；改性油，表面活性剂（有机硅聚合物）； （2） 机械消泡： （3）改变培养基成分。,7、染菌的控制 染菌原因： 设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯； 8、种子罐级数 种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，减少染菌。,任务4 发酵罐的使用和维护,一、发酵罐的结构,1、空气预处理器 2、电动阀 3、电磁流量计 4、空气预滤器 5、空气精滤器 6、蒸汽过滤器 7、pH 电极 8、电动阀（夹套进冷水） 9、电动阀（夹套进热水） 10、通风管 11、消沫电极 12、消沫器 13、搅拌器 14、检测温度的电热偶 15、DO电极
16、16挡板 17电机 18、减速器 19、接种孔 20、出水阀 21、夹套 22、冷凝水排除阀 23、取样与放料阀（三向阀门）,图1-6 100L全自动实验罐结构示意图,二、发酵罐的使用,（一）空气过滤器的灭菌操作 1、灭菌前的准备 启动蒸汽发生器 将自来水引入水处理装置进行除杂、软化处理，处理后留入贮水灌，然后开启自动控制开关进行加热，蒸汽压力达到0.2-0.3Mpa时可供使用。 启动冷冻机 将自来水引入冷冻机，开启冷水机电源开关制冷。当冷水温度达到10时，可供空气预处理使用。 启动空气压缩机 启动前，先关闭空气管路上所有阀门，然后打开空气压缩机电源开关，启动空气压缩机。当空气压缩机的压力达到0.25Mpa左右时，依次打开管路上阀门，将空气引入冷冻机、油水分离器，经过冷却、除油水后进入贮气罐，待用。,2、空气过滤器的灭菌、吹干以及保压,图1-7是100L发酵罐空气管道示意图 1、电动阀 2、电磁流量计 3、粗滤器 4、空气阀门 5、排气阀1 6、压力表 7、精滤器 8、排气阀2 9、空气阀门 10、排气阀3 11、蒸汽阀1 12、空气过滤器 13、蒸汽阀
