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1、第五章 核酸的分离纯化,核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础； 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。,第五章 核酸的分离纯化,DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。 DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。,第五章 核酸的分离纯化,核酸分离纯化的原则 一、 保持核酸一级结构的完整性 二 、尽可能提高核酸制品的纯度,第五章 核酸的分离纯化,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,第二节 基因组DNA的分离纯化,第三节 质粒DNA的提取与纯化,第四节 RNA的分离纯化,第五章 核酸的分
2、离纯化,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,一、材料与方法的选择,二、技术路线的设计,三、核酸的鉴定与保存,第一节 核酸分离纯化的设计及原则,一、材料与方法的选择,（一） 材料与方法的选择,（二） 选择原则,（一） 材料与方法的选择,不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求 需考虑制备核酸所需的时间与成本 应选择安全的试剂与制备方案,一、材料与方法的选择,1、保持核酸碱基序列的完整性 2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度 3、保持核酸的完整性 应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间 尽量避免各种有害因素对核酸的破坏,（二） 选择原则,一、材料与方法的选择,二、技术路线的设
3、计,（一）核酸的释放,（二）核酸的分离与纯化,（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤,（一）核酸的释放,DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。,二、技术路线的设计,表- 各种组织细胞破碎方法,核酸分子抽提的技术设计,核酸的释放： 破裂细胞 释放核酸 机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应 用最广泛的方法） 核酸的分离与纯化： 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液,应该清除的杂质主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类 物质等 2、非需要的核
4、酸分子：分离某一特定的核酸分子 时，其它的核酸分子皆为杂质 3、加入的有机溶剂和某些金属离子,（二）核酸的分离与纯化,二、技术路线的设计,（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤,沉淀是浓缩核酸的最常用的方法 常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁 常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%75%的乙醇洗涤去除,二、技术路线的设计,三、核酸的鉴定与保存,（一）核酸的鉴定,（二）核酸的保存,（一）核酸的鉴定,1、浓度鉴定,2、纯度鉴定,3、完整性鉴定,三、核酸的鉴定与保存, 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收
5、 紫外线，其最大吸收波长为260nm。,1、浓度鉴定,三、核酸的鉴定与保存,各种碱基的紫外吸收光谱,三、核酸的鉴定与保存,荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌 入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激 发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与 溶液中核酸的含量呈正比。,三、核酸的鉴定与保存,EB与DNA的结合, 紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280 的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与 降低均提示不纯。 在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8 纯RNA的A260/A280比值为2.0,2、纯度鉴定,三、核酸的鉴定与保存,1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于
6、 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0,三、核酸的鉴定与保存,浓度鉴定,紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。 如计算DNA浓度 A260稀释倍数50 g/ml 紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20 g/ml单链寡核苷酸）,荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电 泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较
7、 RNA大得多，电泳迁移率低。,三、核酸的鉴定与保存,荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）, 琼脂糖凝胶电泳法： 以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可 判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段 的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果 发生降解，电泳图呈拖尾状。,3、完整性鉴定,三、核酸的鉴定与保存,DNA片段的降解,三、核酸的鉴定与保存,完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。
8、,三、核酸的鉴定与保存,一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。,三、核酸的鉴定与保存,总RNA电泳图谱,三、核酸的鉴定与保存,正常时，28S RNA的荧光强度约为18S RNA的2倍，否则提示RNA的降解,（二）核酸的保存,1、DNA的储存,2、RNA的储存,三、核酸的鉴定与保存,1、短期贮存： 4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存： TE缓冲液中
9、-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,三、核酸的鉴定与保存,（二）核酸的保存,_DNA的储存,2、RNA的储存,RNA溶于0.3mol/L的NaAc溶液或三蒸水中，-70 保存。如用DEPC处理过的水溶解RNA或者在RNA溶液 中加入RNasin或VRC，保存时间可延长。,三、核酸的鉴定与保存,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,第二节 真核基因组DNA的分离纯化,一、酚抽提法,二、甲酰胺解聚法,三、玻棒缠绕法,四、其它方法,五、DNA片段的纯化,六、DNA片段的回收,DNA酚抽提法
10、示意图,一、酚抽提法,一、酚抽提法,该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法 以含EDTA、SDS及RNase裂解缓冲液裂解细胞 经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，获得DNA粗制品,DNA样品准备,常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70或液氮,主要试剂的作用： EDTA：1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2 降低细胞膜的稳定性,SDS的作用： 1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂； 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来； 3 对RNA、DNA酶有抑制作用； 4 与蛋
11、白质形成R-O-SO3 .R蛋白质复合物，使蛋白质变性。,蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用。,酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。 PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。,为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？,苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。
12、氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。,DNA的沉淀,1.无水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。 无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。 2.异丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子。,DNA的浓缩,1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量。 2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。
13、因此重复几次可显著减少DNA体积。,DNA的检测,溴乙锭染色 ：在254nm紫外光下检测，如需回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。 银染法 ：Ag+与DNA形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高200倍，但不能回收。,二、甲酰胺解聚法,1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。,破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子
14、量的DNA样品。可得DNA 200kb左右,三、玻棒缠绕法,现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改进而来。,DNA玻棒缠绕法示意图,三、玻棒缠绕法,四、其它方法,常用的一些分子诊断技术，并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法运用而生并广泛使用 1.异丙醇沉淀法:仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态） 2.玻璃珠吸附法,五、 DNA片段的纯化,常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法（column chromatography）,DNA柱层析法示意图,五、 DNA片段的纯化,六、 DNA片段的回收,原则与要求
15、: 1.提高片段的回收率； 2.清除回收的DNA样品中的杂质。,六、 DNA片段的回收,（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段,（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法,（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,六、 DNA片段的回收,电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的DNA分子。 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。,透析袋电洗脱 ： 切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。,低熔点琼脂糖凝胶： 切下胶，加热到65熔化胶，然后抽提回收DNA。 方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。,玻璃珠洗脱法：将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。,琼脂水解酶：将含DNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA,（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段,
