《三节聚合酶链反应polymerasechainreactionPCR演示教学》由会员分享，可在线阅读，更多相关《三节聚合酶链反应polymerasechainreactionPCR演示教学（26页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1,第三节 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）,PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 体外程序化的DNA合成技术。,2,PCR,3,原 理：,1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度； 2）反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer 3）反应程序： 变性9495oC 复性 延伸 3755 oC 7072 oC 72 oC延伸10min DNA扩增100万倍,4,PCR扩增,6,PCR相关技术：,1.增效PCR（booster
2、 PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经1520个循环后补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。,7,2. 巢式PCR（nest PCR）,此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步
3、PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。,8,在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。,3、多重PCR,9,4.RT-PCR,RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ngug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。,10,RT-PCR,11,RT-PCR,cDNA,1
4、2,五、单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）,是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。 通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。 在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。,13,PCR-SSCP过程：,- primer - 32P-dNTP掺入 PCR扩
5、增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子 .,解链,构像,DAN,原 理,过 程,14,第二节 DNA多态,DNA多态（DNA Polymorphism）： 群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100500bp就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。常用做遗传分析中的标记。 除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。,15,DNA分析中常用的多态性标记有3类：,1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记
6、； 2）重复序列多态性：短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记； 3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。,16,一、序列多态（或点多态）,限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP ）。 由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或新的酶切点出现，从而引起不同个体的DNA在用同一限制酶切割时，产生DNA片段长度的差异。这种由于酶切位点变化导致的DNA片段长度的差异称为RFLP。 RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。,17,Allele II 产生了新的酶切点,
7、Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,RFLPSouthern blot检测结果,18,AlleleII酶切位点消失,19,二、序列长度多态性（或数目变异串联重复，variable number tendom repeats, VNTR）,重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列。散在地分布于染色体上，以插入/缺失方式形成多态。如图： VNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。,20,VNTR 酶切，电泳后的检测结果,大,小,21,PCR-VNTR检测,22,
8、通常，重复单位1628bp长，称为小卫星DNA。 重复单位6bp长，如（TA）n, (CGG)n等，称为微卫星DNA。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）,23,PCR-VNTR,24,生物芯片技术,九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。 基因芯片（又称DNA芯片，生物芯片，DNA探针微列阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。,25,基因芯片,如： 靶基因 基因组 特异性片段 探 针 -AGCTTAGC- 靶序列 -TCGAATCG- probe,A B C,1 2 3 4 5,检测,26,基因芯片的应用：,一、基因组扫描 二、寻找基因功能 三、基因型及单碱基多态（SNP） 四、突变检测 五、基因表达,
