《RNAi课件上课讲义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RNAi课件上课讲义（80页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、siRNA和RNAi,周浩13622001948,主要内容,RNAi的发现简史 RNAi的作用机制和特征 siRNA的制备方法 siRNA的设计原则 RNAi的应用 RNAi实验举例,非编码RNA,RNA干扰（RNA interference，RNAi）,RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA (dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。,RNAi的发现简史,1990年Rich Jorgensen设想，将更多的色素基因注入植物体，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表
2、达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，当时称共抑制（cosuppression)。 1994年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制 (quelling)。,1995年Guo和Kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但没有增加该基因的表达，反而产生与反义RNA同样的结果特异性阻断该基因的表达，从而正式表明RNA 干扰现象的存在。 Cell.1995 May 19;81(4):611-20. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans
3、embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Guo S, Kemphues KJ.,1998年Fire等发现将dsRNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和Kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。他们称此现象为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。 Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis el
4、egans. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11.,mRNA 正义RNA 无抑制（污染） （反向互补）反义RNA 抑制微弱 双链RNA 抑制强烈 蛋白质,Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos
5、. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) ret
6、ain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.),Negative control uninjected,ant
7、isense RNA injected dsRNA,1999年，Hamilton等首次在PTGS（转录后基因沉默）植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物。 2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）引发RNAi。 2000年，Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。,2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，sh
8、RNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。,siRNA,shRNA,2006年诺贝尔生理学或医学奖颁发给2位美国科学家：Andrew Z.Fire和Craig CMello，以表彰其在RNA干扰双链RNA引发的基因沉默领域所做出的杰出贡献。,RNAi现象的普遍性,此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）、共抑制（cosu
9、ppression）及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。,基因沉默,转基因沉默分为转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)两种：,TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默；DNA-hnRNA PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。hnRNA-mRNA,RNAi的作用机制,第一步（起始阶段）是较长dsRN
10、A在ATP参与下被RNase样的特异核酸酶切割加工成2123nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。 siRNA的两条单链末端为5磷酸和3羟基，且3端均有3个突出的核苷酸。果蝇中的RNase样核酸酶称为Dicer。 Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。,第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。,RIS
11、C由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。,RNAi作用机制示意图,Dicer contains two RNAseIII domains,RNAi的放大效应机制,siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。 新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大量的次
12、级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）。,RNAi 具有的特征,转录后水平的基因沉默。 高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。 高效性：相对少量的dsRNA就能完全抑制相应基因的表达。 可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代。,dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。 ATP依赖性：可能是Dice
13、r和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。 位置效应：不同位置的双链RNA对基因沉默效率的不同。,siRNA制备方法,化学合成 体外制备 体外转录 “鸡尾酒”法（用Rnase消 化长片断双链RNA制备siRNA） 体内表达 siRNA表达载体 siRNA表达框架,化学合成,常规化学合成siRNA为19nt + 3overhangs（2nt）的双链RNA，未 经修饰，如图所示。 Sense：正义链，RNA，序列与靶序列相同； Antisense：反义链，RNA，序列与靶序列互补； dTdT：两端悬垂，DNA，均在3端； 形式：双链，已退火；,优缺点：,优点：得到的siRNA纯度高并且无需进行任
14、何其他实验，适用于已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量的siRNA进行研究。 缺点：合成价格高昂，不适用于筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。,化学修饰siRNA,体外转录,以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。,优缺点,优点：价格便宜，试剂盒使用方便。适用于筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合
15、成的价格成为障碍时。 缺点：需要进行其他实验，且siRNA的合成量受到限制。不适用实验需要大量的，一个特定的siRNA进行长期研究。 例如： Ambion的SilencerTM siRNA Construction Kit,用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA,其过程如下：首先针对靶基因的mRNA在体外转录合成长dsRNA；再用RNaseIII或Dicer对长dsRNA进行酶解，形成一组siRNAs的混合物；最后将该混合物导入细胞内。用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免上述两种方法的缺陷。 例如： Ambion的SilencerTM siRN
16、A Cocktail Kit,优缺点,优点：可以避开烦琐的siRNA设计与筛选工作，快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型。 缺点：有可能产生非特异性基因的抑制，而且在有效地抑制基因表达后并不知道真正起作用的siRNA。不适用于长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。,体内表达,前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。 而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。 这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。,siRNA表达载体,针对siRNA进入细胞后容易被降解，并且进入细胞siRNA的数量不受控制的情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链序列克隆入载体内，位于RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。,优缺点,优点：使siRNA直接在体内得
