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1、学习要点,1、真核生物的基因组2、真核生物基因组DNA序列的复杂度3、DNA序列的类别4、卫星DNA5、基因家族、基因簇和假基因的含义6、真核生物基因组的包装过程7、真核生物基因的丢失、扩增和重排8、遗传标记的类型和特点、应用,遗传学,一、真核生物基因组,一、基因组与C值基因组：一个物种单倍体的染色体的数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组（genome）。C值：一个物种单倍体基因组的DNA含量是相对恒定的，它通常称为该物种DNA的C值。不同物种之间C值相差极大。,遗传学,遗传学,遗传学,二、真核生物基因组的结构特点1真核生物基因组大部分位于细胞核中，一般由多条染色体组成，每条染色体又是由
2、DNA分子与蛋白质稳定地结合成染色质的多级结构.2每条染色体的DNA分子具有多个复制起点，基因内存在着不表达的插入序列，即内含子。,遗传学,3存在大量不编码蛋白质的DNA序列，如果蝇的基因数估计约为5000个，占基因组DNA序列的10左右，人的基因数推测为50000个，约占基因组DNA序列的1。4真核生物的蛋白质编码基因往往位于基因组DNA单拷贝序列中，除单拷贝序列外还存在大量重复序列（repeatsequence），重复序列的拷贝数可高达百万份以上，在人的基因组中，至少具有20份拷贝的DNA可占总DNA的30左右。,遗传学,5真核生物基因组中，有许多结构相似、功能相关的基因组成所谓的基因家族
3、（genefamilies）。同一基因家族的成员可以紧密地排列在一起，成为一个基因簇。也可以分散在同一染色体的不同部位，或位于不同的染色体上。6真核生物除了主要的核基因组外，还有细胞器基因组，而且细胞器基因组对生命是必须的，,遗传学,二、真核生物基因组DNA序列的复杂度,一、重复序列的检测通过复性动力学来检测基因组DNA序列的复杂性。也就是通过DNA的变性（denaturation）和复性（renaturation）反应的动力学过程分析DNA序列的性质。公式：单链消失速度的微分方程为：,其中：C为单链DNA的浓度（单位是每升的核苷酸摩尔数）；t为时间（单位为s）；k为重组速率常数（单位是Lmo
4、ls），k取决于阳离子浓度、温度、片段大小和DNA序列的复杂性。,遗传学,当t=0时，CC0，表明所有DNA都是单链，C0为DNA总浓度。,复性的分数CC0是起始浓度和经过时间的乘积C0t的函数,遗传学,遗传学,从方程式可见控制复性反应的参数是C0t，如当tt1/2时，即,遗传学,如果基因组中每一种基因只有一个，即都是单拷贝序列，那么基因组愈大则基因组的复杂性愈大，复性速率愈小，k也愈小，所以C0t1/2与非重复序列的基因组大小呈正比。即,遗传学,二、DNA序列的类别（一）单拷贝序列（uniquesequence）亦称非重复序列（nonrepetitivesequence）在一个基因组中只有一
5、个拷贝或2-3个拷贝。（二）中度重复序列（moderatelyrepetitivesequence）中度重复序列中的重复单位平均长度约300bp，重复次数为10102。,遗传学,（三）高度重复序列（highlyrepetitivesequence）顾名思义，高度重复序列就是在基因组中存在大量拷贝的序列，一般重复次数在106以上。通常这些序列的长度为6200bp，如卫星DNA。,遗传学,遗传学,三、卫星DNA卫星DNA(satelliteDNA)是一类高度重复序列DNA在介质氯化铯中作密度梯度离心，离心速度可以高达每分钟几万转；此时DNA分子将按其大小分布在离心管内不同密度的氯化铯介质中，小的分
6、子处于上层，大的分子处于下层；从离心管外看，不同层面的DNA形成了不同的条带。,遗传学,根据荧光强度的分析，可以看到在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带。这些在卫星带中的DNA即被称为卫星DNA，这种DNA的GC含量一般少于主带中的DNA，浮力密度也低。,遗传学,卫星DNA按其浮力密度的大小可以分成I、四类，其浮力密度分别是1687，1693，1697和1700gcm3。各类卫星DNA都是由各种不同的重复序列家族所组成。卫星DNA通常是串联重复序列。,遗传学,卫星DNA按其重复单元的核苷酸的多少，可以分为两类。一类是小卫星DNA(minisatelliteDNA)，由几百个核苷酸对的单元重复
7、组成。另一类是微卫星DNA(microsatelliteDNA)，由2个到20个左右的核苷酸对的单元重复成百上千次所组成。,遗传学,三、基因家族,一、基因家族的类型和Alu家族、含义：真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样的一组基因称为一个基因家族（genefamily）。、分布可在分布在一条染色体上，也可以分布在不同染色体上。,遗传学,、分类简单的多基因家族；复杂的多基因家族；不同场合表达的复杂多基因家族（图7-7）。,遗传学,遗传学,、常见的基因家族5SrRNA基因家族海胆和果蝇的5个组蛋白基因家族、Alu家族（Alufamily）成员众多，大约平均每6kbDNA
8、就有一个，总数大约有300000个。都是由300bp的短序列构成。结构特点：,遗传学,在这些300bp的顺序中含有一个限制性内切酶AluI的特异性识别顺序AGCT，由此将这些300bp的序列切割为两个片段，一个片段为170bp，另一片段为130bp，说明这是一类长度相似、性质相似的重复序列，因此称之为Alu家族。、其他家族如KpnI家族、Hinf家族与多聚（dT-dG）家族等。,遗传学,二、基因簇和假基因、基因簇一个基因家族的成员紧密连锁成簇状排列在某一染色体上，形成一个基因簇（genecluster）。、假基因在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，但在结构和DNA序列上与有功能的
9、基因具有相似性，这种成员称为假基因（pseudogene）。,遗传学,四、真核基因组的包装,一、DNA与染色体1、染色体和染色质2、染色体的主要组分二、核小体结构和包装模型核小体是构成染色质的基本结构单位。其结构如下图所示。,遗传学,遗传学,从核小体到染色体140bp的双螺旋DNA缠绕于4种组蛋白形成的八聚体外面-核小体理论：140bp0.34nm47.6nm，实际核小体为直径9nm，DNA分子长度被压缩了56倍。60bp的双螺旋DNA及组蛋白1-间隔区,遗传学,每6个核小体通过间隔区相连-空心螺线管空心螺线管外径30nm,螺距10nm，DNA分子长度又被压缩了6倍。,遗传学,120个螺线管又
10、盘绕-超螺线管（染色体的单位纤维）超螺线管直径400nm，高30nm，长1060nm,DNA分子长度又被压缩了40倍。,遗传学,超螺线管进一步螺旋或盘旋-染色单体染色单体实际长度为210nm,DNA分子长度又被压缩56倍。,遗传学,人体每个细胞中长约1.7米的DNA双螺旋链经许多核小体组成的串珠样纤维经多层次螺化，最终压缩了约8400倍形成染色单体。46个染色单体长仅200m左右，储于细胞核中。,遗传学,遗传学,遗传学,五、真核生物基因的丢失、扩增与重排,一、基因的丢失通过丢失染色体，丢失某些基因而去除这些基因的活性的现象。,遗传学,二、基因扩增基因内某些基因的拷贝数专一性地大量增加的现象。三
11、、基因重排指DNA分子核苷酸序列的重新排列。,遗传学,六、遗传标记,遗传标记的特征:亲本间存在着多态性（即差异），也就是说具有可识别性。亲本间存在的多态性在后代中可以重演，即具有可遗传性。,遗传学,遗传标记的类型:形态标记,或可见标记（visiblemarkers）细胞学标记（cytologicalmarkers）同工酶标记（isozymemarkers）DNA标记（DNAmarkers）,遗传学,形态标记或可见标记（visiblemarkers）:是指在个体上可以看见的遗传标记，如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆）等。,遗传学,水稻部分形态学标记性状及其基因性状分类标记性状已鉴定的基因举
12、例色素紫色叶耳Pau紫色叶舌Plg紫色谷壳Pr黑色谷壳Bh紫色柱头Wh紫色叶鞘Psh籽粒有芒An-1,An-2,An-3内颖发育不全dp-1,dp-2大胚ge圆粒rk-1,rk-2多雌蕊mp-1,mp-2,遗传学,细胞学标记（cytologicalmarkers）:是指细胞学上能观察到的遗传标记，主要是指染色体上可以识别的特征，如染色钮（玉米第9染色体末端）、带纹等。,遗传学,同工酶标记（isozymemarkers）:是指以同工酶带型为标记，通过电泳使同工酶带型产生多态性，如酯酶同工酶、过氧化氢酶同工酶等。,遗传学,DNA标记（DNAmarkers）:是指以DNA片段为标记，通过DNA片段的
13、电泳使DNA产生多态性，如RFLP等。,遗传学,形态标记、细胞学标记、同功酶标记存在的问题是：这些标记在数量上都是有限的。虽然经过近百年的努力，目前这些标记的数量仍然不多，因此限制了这些标记的利用。这些标记在操作上比较麻烦，难以开展大规模的研究和利用。,遗传学,DNA标记具有的优势：在数量上是巨大的；操作相对简单，适合大规模开展工作；标记比较明显，容易识别；受环境影响少，标记本身就是遗传物质；,遗传学,同工酶标记和DNA标记都是分子标记。但目前分子标记一般指DNA标记。,遗传学,RFLP(Restrictionfragmentlengthpolymorphism)，译为限制性片段长度多态性。B
14、otstein等1980年首次发现，以后被大量利用，在微生物、植物、动物和人类上都得到了广泛的利用。RFLP标记是最早利用的DNA标记，在技术上比较复杂，涉及多个环节。,6.2RFLP6.2.1DNA提取,遗传学,遗传学,RFLP标记是最早利用的DNA标记。做RFLP分析，需要提取生物体内的DNA，并对DNA进行体外处理。因此，DNA提取是RFLP分析的第一个环节。DNA提取的方法很多，不同的生物所用的方法也不同。DNA提取的基本原理和过程主要包括以下几个方面。,遗传学,生物体样品的选取:动植物生物体由不同的器官和组织构成。应选用生物体中生长旺盛的器官、组织和细胞提取DNA，如植物幼苗或新长出
15、的叶片、动物的血等。DNA提取的效果由DNA的质量和得率来评价。选用适当的生物器官和组织是获得高质量和高得率DNA的保证。取样后应尽快在低温中保存，长时间保存应在超低温中保存。,遗传学,细胞的裂解：作为DNA提取的开始，多细胞的生物体样品首先需要经过研磨，使样品破粹。然后样品粉末再通过裂解液把细胞裂解。裂解液通常是由TrisTris（hydroxymethyl）aminomethane，即三羟基甲基氨基甲烷缓冲液加裂解剂组成，如SDS（Sodiumdodecylsulfate）即十二烷基磺酸钠、CTAB（Hexadecyltrimethylammoniumbromide）即十六烷基三甲基溴化铵
16、等。,遗传学,蛋白质的沉淀：通常使用能使蛋白质变性的试剂，如醋酸钾、醋酸钠、氯仿等。RNA的消化：通常使用RNA酶。,遗传学,DNA沉淀：通常使用冰冻的异丙醇（2-ropanol）、70%乙醇等。DNA溶解：通常使用TE缓冲液（10mMTris，1mMEDTA，pH8.0，灭菌）。EDTA（didodiumethylenediaminetetra-acetate）即乙二胺四乙酸。,遗传学,6.2RFLP6.2.2Southernblotting,印迹转移（Southernblotting）是由E.M.Southern于1975年发明的，故名。,遗传学,限制性片段的产生：DNA是大分子。水稻基因组的大小是4.3x108bp,小麦是1.6x1010bp。限制性内切酶能识别DNA上的限制性位点。利用限制性内切酶可以把DNA分解为具有一定长度的片段，这就是限制性片段。,遗传学,遗传学,电泳：电泳用的凝胶由琼脂糖（agarose）制备，琼脂糖的浓度通常为0.9-1.0%。酶切后的DNA样品通过电泳，使DNA片段分离,并按分子量的大小排列。
