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1、课程名称：医学微生物学,教学内容：细菌感染的检查方法及防治原则,学时：学时,教学目的：掌握临床细菌标本的采集、送检原则,革兰染色法的步骤熟悉病原菌的检验程序、常用血清学试验的原理了解细菌学检查在临床诊断中的重要性,教学方法：理论,教学重点、难点、关键：病原菌的检验程序,细菌学诊断(bacteriologicaldiagnosis),示踪性检测形态学检查分离培养生化试验血清学鉴定,致病力和药敏测定动物实验毒力检测药物敏感试验,病原微生物感染的检查法,3.早期取材(1)疾病早期(2)使用抗菌药物之前,如已用抗生素,应停用12天(3)机体免疫因素形成之前(4)未出现合并或继发感染之前,4.快速送检:
2、大多数细菌低温送检,但奈瑟球菌须30-40保温送检,标本采集的准确性是检查结果可靠性的保证,1、直接涂片镜检,形态与染色性具有特征的病原菌可直接染色镜检，根据典型形态、排列、染色性做初步诊断,(一)、病原菌分离鉴定的一般程序：,一、形态学检查,(1)不染色标本的检查主要用于观察病原菌的某些形态特点及运动性常用的方法有压滴法和悬滴法如:用压滴法观察霍乱弧菌的“鱼群样运动”,暗视野检查用于检查活菌、螺旋体及其动力,(2)染色标本的检查,染色,单染,复染,正染,负染(negativestaining),革兰染色法,抗酸染色法,荧光染色,单染色:只用一种染料进行染色.,可分为:正染:标本着色,背景不着
3、色负染:标本不着色,背景着色,用于形态的观察,不能鉴别染色性,复染色:用两种或两种以上的染料进行染色,目前常用的有:革兰染色法、抗酸染色法、荧光染色、特殊染色法,既可观察形态结构,又可鉴别染色性,革兰染色法步骤:,制片:涂片,染色:,结晶紫初染1分钟,水冲洗,碘液媒染1分钟,水冲洗,95%乙醇脱色30秒左右,水冲洗,稀释复红复染30秒,水冲洗,干后油镜下观察,干燥,固定,涂片,干燥,固定,染色,镜检,结果:染成紫色称革兰染色阳性G+染成红色称革兰染色阴性G-,原理:(1)等电点学说结晶紫为碱性染料,(2)化学学说G+含有核糖核酸镁盐,能与结晶紫形成牢固的复合物,(3)通透性学说,G+G-,PI
4、2346,核糖核酸镁盐+-,通透性小大,脂质少多,意义:(1)鉴别细菌(2)指导临床用药(3)了解细菌的致病性,二、分离培养纯培养：,根据不同标本采取不同培养基。,分离化脓性球菌如链球菌、肺炎球菌可采用血平板；分离脑膜炎球菌可采用巧克力平板,菌落形态观察:大小、表面、透明度、边缘、高度、色素、溶血等,三、生化反应：,通过检测细菌代谢产物的生化反应鉴定细菌的种类,乳糖发酵试验、甲基红试验、硫化氢试验等。,四、血清学鉴定:(serologicalidentification)：,用已知抗体检测标本中分离得到的病原菌的血清型别，采用玻片凝集法。,原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平
5、板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。,纸片扩散法（Kirby-Bauer法）,五、药敏试验：,纸片扩散法,原理：聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时加入100l浓度为105CFU/ml的菌液，盖上盖板，351620h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，通过CLSI标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种环取肉眼观察无菌生长的液体接种
6、于血琼脂平板作次代培养，经35过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死99.9原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)。,微量液体稀释法(microdilutiontest),用微量加样器接种100l到96孔中，盖上盖板。同时作阳性、阴性对照。,手工看浊度或仪器自动判读。按照CLSI标准报告细菌对某抗菌药物为敏感、耐药和中介。,原理：E试条是一条5mm50mm无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈
7、的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度，对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。,E-TEST,孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC)。,六、细菌成分的检测(detectionofbacterialantigens)：,目前应用最为广泛的是细菌抗原的检测,如:协同凝集试验、间接凝集试验、荧光抗体法、酶免疫法、核酸杂交、聚合酶链反应等,七、检测细菌相应抗体,均为免疫学方法,经典方法如:凝集试验、沉淀反应、补体结合试验,现代快速方法主要是免疫标记技术,通常采用取双份血清，其间间隔12周。后一份血清抗体效价比前一份升高4倍
8、以上有诊断意义。,细菌感染的实验诊断,病原微生物感染的防治原则,微生物感染所导致的感染性疾病的控制由预防和治疗两方面组成,预防:对病原微生物传播的各个环节进行控制,治疗:是通过抗微生物药物和新医疗技术来控制传染病的扩散和发展,病原微生物感染的防治原则,特异性免疫的分类,自然免疫,人工免疫,自然主动免疫：隐性或显性感染,自然被动免疫：通过胎盘或初乳获得母体抗体,人工主动免疫：接种疫苗或类毒素等,人工被动免疫：注射抗毒素或丙种球蛋白等,第6章细菌耐药性,第一节抗菌药物的种类及其作用机制一、抗菌药物概念1.抗菌药物（antibacterialagents）指对病原菌具有抑制或杀灭作用、用于预防和治疗
9、细菌性感染的药物，包括抗生素（antibiotics）和化学合成的药物。,2.抗生素（antibioticagents）：微生物在其代谢过程中产生的能杀灭或抑制其它特异病原微生物的产物。抗生素分子量小，低浓度就能发挥其生物活性，有天然和人工半合成两类。,二、抗菌药物的种类（一）按抗菌药物化学结构和性质分类：1.-内酰胺类（-lactam）,青霉素（penicillin）类：青霉素G、甲氧西林等。头孢菌素（cephalosporin）类：头孢唑啉等。头霉素：如头孢西丁。单环-内酰胺类：如氨曲南。碳青霉素烯类：亚胺培南与西司他丁合用称泰能。-内酰胺酶抑制剂：如舒巴坦棒酸使酶失活。,2.大环内酯类（
10、macrolides）红霉素、螺旋霉素等。3.氨基糖苷类（aminoglycosides）链霉素、庆大霉素4.四环素类（tetracycline）四环素、强力霉素等。5.氯霉素类（chloramphenic）包括氯霉素、甲砜霉素。,6.化学合成的抗菌药物磺胺类：磺胺嘧啶（SD）、复方新诺明（SMZco）等。喹诺酮（fluroqinolone）类：包括氟哌酸、环丙沙星等。7.其他抗结核药物：利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺等。多肽类抗生素：多粘菌素类、万古霉素、杆菌肽、林可霉素和克林霉素等。,（二）按生物来源分类1.细菌产生的抗生素如多粘菌素和杆菌肽。2.真菌产生的抗生素如青霉素及头孢菌素，现
11、在多用其半合成产物。3.放线菌产生的抗生素放线菌是生产抗生素的主要来源。其中链霉菌和小单孢菌产生的抗生素最多。常见的抗生素包括链霉素、卡那霉素、四环素、红霉素、两性霉素B等。,根据对病原菌的作用靶位，将抗生素的作用机制分为四类（表6-1）。1.抑制细菌细胞壁合成2.影响胞浆膜通透性（多粘菌素）3.抑制蛋白质合成（大环内酯类、氨基糖甙类）4.抑制核酸代谢：叶酸代谢；核酸合成（喹诺酮、磺胺类）,三、抗菌药物的作用机制,表6-1抗菌药物的主要作用部位,一、细菌的耐药性,（一）细菌耐药性（drugresistance）亦称抗药性，是指细菌对某抗菌药物（抗生素或消毒剂）的相对抵抗性。指病原体或肿瘤细胞对
12、反复应用的化学治疗药物敏感性降低或消失的现象。（二）耐药性的程度用某药物对细菌的最小抑菌浓度（MIC）表示。临床上有效药物治疗剂量在血清中浓度大于最小抑菌浓度称为敏感，反之称为耐药。,(三)耐药性产生的机制,1.产生水解酶和钝化酶,2.改变细胞膜的通透性,3.改变药物作用位点,4.主动外排泵的作用,5.生物膜形成,(四)控制耐药性的策略,1.合理用药,2.严格执行消毒隔离制度,3.研制新的抗菌药物,4.破坏耐药基因,药敏实验等指导,(四)控制耐药性的策略,1.合理使用抗菌药物制定抗生素用药常规，教育医务工作者和病人规范化用药，供临床选用抗菌药物参考。严格根据适应证选用药物,病人用药前应尽可能进
13、行病原学检测，并进行药敏试验，作为调整用药的参考。按药物的药动学特性，制定合理的用药方案。用药疗程应尽量缩短，一种抗菌药物可以控制的感染则不任意采用多种药物联合。严格掌握抗菌药物的局部应用、预防应用和联合用药，避免滥用。,2.严格执行消毒隔离制度,3.加强药政管理,4.研发新抗菌药物,5.破坏耐药基因,传染病控制三大原则:,1.查明和控制传染源,2.切断传播途径,3.提高健康人群的免疫力,消毒与灭菌是控制传染源的重要手段,消毒与灭菌,消毒（disinfection）：,杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽孢的细菌或非病原微生物。,灭菌（sterilization）:,杀死物体上所有微
14、生物的方法。,包括致病菌、非致病菌、繁殖体和芽胞。,抑菌：,抑制体内或体外细菌的生长。,防腐：,防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法,无菌（asepsis）：,没有活菌的意思。无菌状态是灭菌的结果。,无菌操作（antiseptictechnique）：,防止细菌进入人体或其他物品的操作技术。,物理消毒灭菌法,一、热力灭菌法,热力灭菌法有干热灭菌和湿热灭菌两大类,在同一温度下，后者比前者的效力大。这是因为：,*湿热中菌体蛋白较易凝固。,*湿热的穿透力比干热大。,*湿热的蒸汽有潜热存在。,为什么湿热灭菌比干热灭菌效力大,干热灭菌：,干热的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性。,1.焚烧法：直接点燃或在焚
15、烧炉内焚烧。是一种彻底的灭菌方法。,适用于废弃物品或动物尸体。,2.烧灼法：直接用火焰灭菌。,适用于接种环，试管口等的灭菌。,3.干烤法：将物品置干烤箱内，加热至1601700C2h。,适用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品。,4.红外线：利用电磁波的热效应灭菌。110m波长的热效应最强。,适用于医疗器械的灭菌。,湿热灭菌：,利用热蒸汽的高温使微生物的蛋白质变性。,1.巴氏消毒法：,用较低温度61.162.80c，30min;71.70c,1530s杀灭液体中的病原微生物或特定的微生物，而仍保持物品中所需的不耐热成分不被破坏的消毒方法。,用于牛乳制品、酒类等的消毒,2.煮沸法:,1000c,
16、水浴，30min。食具、一般外科器械消毒。杀死芽胞需13小时。,3.流动蒸气消毒法：,1000c,汽浴，30min,可杀死细菌繁殖体，但不能杀死芽胞。,4.间歇蒸汽灭菌法：,1000c,汽浴,30min/次,流通蒸汽消毒法重复三次，每次间歇期置37温箱过夜，促使芽胞发芽变为繁殖体，被下一次蒸汽灭菌时杀灭。主要用于营养培养基的灭菌，可杀死芽胞。,5.高压蒸汽灭菌法：,121.30c汽浴（103.4kPa），1520min,可杀灭包括细菌芽孢在内的所有微生物,用于培养基、生理盐水、手术敷料等耐高温、耐湿物品的灭菌。,灭菌效果最好、应用最广泛的灭菌方法。,二、辐射杀菌法,（一）紫外线（ultravioletray，UV）杀菌,波长200300nm的紫外线有杀菌作用，其中以260266nm最强。,*杀菌机制：干扰DNA的复制与转录。,*杀菌作用特点：杀菌作用强,穿透力弱。,*适用范围：,手术室、传染病房、细菌实验室的空气消毒,或不耐热物品的表面消毒。,（二）电离辐射：高速电子、射线、r射线等。,应用范围：一次性医用塑料制品；食品。,三、
