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1、学习心得1、扦样分样技术1、袋装种子扦样频率a 1-4 个容器，每个容器扦取 3 个初次样品；b 5-8 个容器，每个容器扦取 2 个初次样品；c 9-15 个容器，每个容器扦取 1 个初次样品；d 16-30 个容器，种子批中扦取 15 个初次样品；e 31-59 个容器，种子批中扦取 20 个初次样品；f 60 或更多容器，种子批中扦取 30 个初次样品。以前扦样有时没有严格按照这个标准来取，以后取样要严格按照标准执行。2.制备送验样品（1）需磨碎的种类 100g，不需磨碎的为 50g；（2）真实性样品 100g。3.机械分样法混合 2-3 次，对分递减分至所需重量，每类样品要独立分取。4
2、.如果发现种子异常，要进行异质性检测判定。2、抓关键技术环节，控制影响因素1.检验员（人） （1）熟悉有关的法律、法规规定对种子法还不熟悉，种子检验理论和技术还有待加强和提高。（2）具有良好的职业道德爱岗敬业，诚实守信，客观公正，遵纪守法等。2.种子生活力和种子活力种子生活力：种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力。反映的是种子发芽率和休眠种子百分率的总合。种子活力是指在广泛的环境条件下，决定可接受发芽率的种子批的活性和性能那些特性的综合表现。与种子田间出苗质量密切相关。3.发芽结果计算与表示当重复正常幼苗百分率都在容许差距范围内，则取其平均数；当重复间超过容许差距时，要重新试验。4.发芽试验数
3、据修约a) 先将正常幼苗百分率修约至最接近的整数，0.5 进位，并与其余部分（不正常幼苗、硬实、新鲜种子和死种子）百分率整数部分的数值相加。如果总和为 100，则修约程序结束。b) 执行 a)程序后的总和不是 100，则在不正常幼苗、硬实、新鲜种子和死种子百分率中找出小数部分最大数值者，将此修约至整数，并作为最终结果。并与其余部分百分率整数部分的数值相加。如果其总和为 100，则修约程序结束。c）执行 b)程序后的总和不是 100，继续重复执行 b)程序，直至获得总和为 100。d) 执行 b)和 c)程序时，凡小数部分均相同的，按照下列顺序优先进行修约：不正常幼苗、硬实、新鲜种子和死种子。5
4、. 发芽试验重复间和重复试验间超差的处理：（1）假如四次重复间最高和最低值的差距在容许误差范围内，该发芽试验的结果是可靠的。将各重复的平均数修约成最接近的整数，查容许误差表，如重复间的最大差异小于规定的容许误差，则认为结果是可信的。容许误差至少适用于正常幼苗种类。（2）当重复间的差距超过表中最大容许误差时，应采用同样的方法重新试验。如果第二次结果与第一次结果相符合，即其差异不超过表中规定的容许误差，则填报两次试验的平均数。（3）如果第二次结果与第一次结果不相符，即其差异超过表中所示容许误差，则采用同法第三次试验，如果三次试验的结果相符合，即其差异不超规定容许误差，则填报三次试验结果的平均数。如
5、果三次试验结果不相符，即其差异超过规定容许误差，则三次试验结果进行两两比较，取不超过容许误差的一对结果的平均值作为最后结果。若第三次试验仍得不到符合要求的结果，则应考虑人员操作、仪器设备或其他反面原因。三、实验室质量管理1、质量法规对产品质量法 、 标准化法 、 种子法 、 农作物种子标签和使用说明管理办法等的学习有待进一步学习。2、质量与检验（1）从过程管理的角度来看，质量绝对不是检验出来的，预防产生质量，检验不能产生质量；（2）合格产品不是检验出来的，而是干出来的；（3）检验可以发现不合格产品。3、种子检验室质量管理应建立相适应的有效的管理体系，形成文件，将抽样到结果报告各环节检验活动标准
6、化、制度化。管理体系文件一般包括四个层次：质量手册 、 程序文件 、 作业指导书 、 记录格式 。4、试验要求（1）若发现试验结果异常，试验人员不要轻易下结论，应认真查记录、查计算、查操作、查试剂、查方法、查样品，找出原因后有针对性地进行复验。（2）要认真及时做好原始记录，要求所有的实验内容都要有原始记录，不得漏记。5、记录控制要求（1）试验数据应用中性笔或钢笔在实验同时记录在原始记载表上，不应事后抄录，也不应漏记。试验中出现的异常情况也应及时记录。书写要求工整、清楚、真实、准确、完整。不准用铅笔记录，不得随意涂改、乱写、乱画和折叠。当发生笔误时，用“”注销，并在“”上方由本人更正，加盖改正章
7、。（2）试验原始记录要按年编目成册，做好标识，归档保管。（每年做一次整理归档） 。6、检测数据修约规则（1）称重规定：1g 以下保留四位小数，110g 保留三位小数，10100g 保留二位小数，1001 000g 保留一位小数。（2）在净度分析中，各成分之和是 999或 1001，从最大值(通常是净种子成分)增减 01。（3）数字修约规则：“四舍六入五成双”法则。（4）检测室报出数值最右的非零数字为 5 时，应在数值后面加“( + )”或“( -)”或不加符号，以分别表明已进行过舍进或未舍未进。四、净度分析水分测定1、净种子 未成熟的、瘦小的、皱缩的、带病的或发过芽的种子单位都应作为净种子。2
8、、试验样品的分取试验样品至少含有 2500 个种子单位的重量，玉米种子不少于 900 克。3、净度分析称重计算（1）如果增失超过原试样重量的 5%，必须重做。（2）如增失小于原试样重量的 5%，则计算各组分百分率。各组分百分率的计算应以分析后各种组分的重量之和为分母，而不用试样原来的重量。（3）若分析的是全试样，各组分重量百分率应计算到一位小数。若分析的是半试样，各组分重量百分率应计算到二位小数。4、净度分析容许差距实际差距容许范围内，取其平均值。如超过，再分析一份试样，若分析后的最高值和最低值差异没有大于容许误差 2 倍时，填报三者的平均值。4、净度分析容许差距若一种组分的结果为零，须在适当
9、空格内用“-0.0-”表示,若其一组分少于 0.05%，则填报“微量” 。五、玉米品种鉴定技术-SSR 标记法1、SSR 技术特点多态性丰富，分辨能力强，每个位点最多可含有十多个等位基因；较高重复性，针对于每个位点设计特异性引物，扩增均为特异性目的片段扩增；前期研发基础强，有大量已知染色体位置的共享位点；为共显性标记，能准确区分不同等位变异；为中性变异标记；数据形式为具体片段长度，能够实现数据标准化；技术非常成熟，检测方法简便易行；SSR 技术易于推广，不受专利限制。2、DNA 提取的原则（1）保证 DNA 结构的完整性；（2）将蛋白质、多糖、多酚等杂质降低到最低程度；（3）排除有机溶剂和金属
10、离子的污染；（4）纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质；（5）排除其他核酸分子的污染。3、快速碱煮法（1）碱：在碱性环境下裂解细胞，使 DNA 变性，从而达到提取的目的。碱能够使 DNA 变性，且不会复性，并缠结成网状物质析出最终加入 TE 溶液溶解。（2）煮：煮沸的方式能够代替液氮冷冻法，抑制 DNA 酶的活性，防止煮沸还能够代替研磨，破坏细胞壁和细胞膜，释放出 DNA。4、核酸提取注意事项最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融材料应适量，过多会影响裂解，导致 DNA 量少，纯度低5、DNA 提取量少（1）主要原因实验材料不佳或量少；破壁或裂解不充分；沉淀不完全；洗涤时 DNA 丢失
11、（2）解决方法尽量选用新鲜（幼嫩）的组织；样品预处理充分；适当延长高温裂解时间；用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒；低温沉淀，延长沉淀时间，加沉淀辅助物6、PCR 扩增（1）PCR，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程。是一项 DNA 体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的 DNA。（2）一是被扩增的 DNA 所需量极小，理论上讲一个分子就可以用于扩增了；二是扩增效率高，几个小时就扩增1000 万倍以上。7、PCR 反应体系及循环条件PCR 反应是 Taq 酶以 dNT
12、P 为原料，以一对寡核苷酸引物为起点，以被扩增的 DNA 序列为模板在 PCR 热循环仪中进行的扩增反应。标准的 PCR 过程分为三步：1.DNA 变性（90-96）：双链 DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成单链 DNA。2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与 DNA 模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-75）：在 Taq 酶（在 72左右，活性最佳）的作用下，以 dNTP 为原料，从引物的53 端延伸，合成与模板互补的 DNA 链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA 含量即增加一倍。8、模板 DNA 对 PCR 反应的影响（1）模板纯度：蛋白、酚类、多糖等杂质会抑制 PCR
13、反应；（2）模板完整性：模板 DNA 降解会导致 PCR 无扩增产物；（3）模板浓度：实验表明：在一定范围内 PCR 的产量随模板的浓度的升高而显著升高。模板的量与循环数要匹配,如果循环数一定,模板的量太少,会出现阴性结果或条带很弱;模板的量太多,则会出现条带弥散,模糊不清。（4）PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度（5）PCR 反应体系中引物的浓度一般为 0.10.5umol/L，在此范围内，PCR 的产物量基本相同。（6）若引物量过低会导致 PCR 产物量降低，而如果引物量过高，则会引起碱基的错配和非特异性扩增、生成引物二聚体，从而使目的 DNA 片断的扩增量下降。（7
14、）通常引物量应当 10 倍于靶序列。此外，引物的 Tm 值与退火温度相关，故引物的 Tm 值最好在 5580的范围。（8）高浓度 dNTP 易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。（9）PCR 中常用终浓度为 50-400M 的 dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低） ，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。（10）此外，dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。因此，dNTP 的浓度直接影响到反应中起重要作用的 Mg2+浓度。（11）耐热 DNA 聚合酶的活性依赖
15、于反应体系中的二价阳离子。（12）反应体系中 Mg2浓度过低，会显著降低酶的活性；而 Mg2浓度过高时，又使酶催化非特异性扩增增强。（13）Mg2浓度还会影响引物的退火、模板与 PCR 产物解链的温度，从而影响扩增片度的产率。（14）由于在 PCR 反应体系中的模板 DNA、dNTP、引物中的磷酸基团均可与 Mg2结合从而降低反应体系中的 Mg2的浓度，而耐热 DNA 聚合酶需要的是游离的 Mg2，因此，一般 Mg2的加入量应比 dNTP 的总浓度高 0.22.5mmol/L。（15）在不同的反应体系中模板 DNA、引物以及 dNTP 的量各不相同，因此应根据具体的情况来确定特定 PCR 反应
16、体系中 Mg2的最适浓度。9、PCR 循环条件模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 95左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 60左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。在最后一个循环后，反应在 72维持 5-15 分钟。使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。10、无扩增产物（1）原因 模板含有抑制物，模板含量低；该 Buffer 对样品不合适；引
