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1、.,Clampfit 10 膜片钳实验数据的处理与分析,2014年4月23-25日 杭州 浙江大学,膜片钳技术高级培训班,刘振伟,.,2,一、膜片钳实验数据的处理 二、全细胞记录数据的分析 三、单通道记录数据的分析 四、突触放电活动数据的分析,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,内容,.,3,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,一、基线的调零 二、坏点的去除 三、滤波 四、数据文件内部/之间的数学运算,.,4,Patch clamp training class,Apr
2、. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,一、基线的调零,基线的确认 全细胞记录基线易确认，单通道记录基线不易确认。 单通道开放时间较长 所记录的时间较短 同时开放的通道数目较多且长时间持续开放 确定通道电流的方向：电流方向向上，最负向是基线位置，反之亦然。 如何确定：膜片两侧液体、钳制电位,.,5,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,.,6,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,基线不在零点的原因 封接电阻的改变：漏电流 失调电位的存在：偏
3、移、漂移 噪声的干扰：交流干扰 高通滤波的影响：对记录线的起始部位产生影响,.,7,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,基线调零方法 打开Analyze/Adjust/Baseline （1）Subtract mean of（去除均值法）：适用于去除直流偏移。 （2）Subtract slope of（去除斜率法）：适合于去除持续线性漂移。 （3）Subtract fixed value（去除固定值法）：适用于去除直流偏移。数值有正负之分。 （4）Adjust manually（手工调零法）：适合于单通道电流的基线或基线
4、漂移无规律。,.,8,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Epoch A段,（1）Subtract mean of（去除均值法）（2）Subtract slope of（去除斜率法）,.,9,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,（3）Subtract fixed value（去除固定值法） （4）Adjust manually（手工调零法）,.,10,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验
5、数据的处理,基线调零的注意事项 （1）有些只相对值（如电流幅度的变化值），不需要将基线调零。但多数情况需要基线调零，建议都要进行基线调零。 （2）对于基线变动复杂的数据，基线调零可能会用到上述的几种方法。 （3）对于某些基线变动，Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。建议最好在采集数据时就设法调整好基线。,.,11,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示基线调零方法,.,12,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,二、坏点的去除,坏点产生的
6、原因 刺激伪迹：给标本施加刺激时产生。 电容瞬变电流：电容的充放电反应。 瞬时脉冲干扰（Glitch）：打开电源开关（日光灯、仪器设备开启时） 手机来电：一过性高频。 人手靠近记录探头：高幅、高频。,膜片钳实验数据的处理,.,13,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,坏点的赋值 （1）Data value at cursor 1：Cursor 1的数值。 （2）Mean between cursor 1.2：Cursor 1-2之间均值。 （3）Mean between cursor 3.4：Cursor 3-4之间均值。 （4）Straig
7、ht -line fit between cursor 1.2：Cursor 1-2之间的直线拟合值。 （5）Fixed value(pA/mV)：输入一个固定的数值。,膜片钳实验数据的处理,.,14,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示去除坏点,.,15,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,注意事项 （1）坏点太多时，应在记录前予以去除。 （2）坏点持续时间短，如果出现持续时间较长的坏点，则数据要废弃。,膜片钳实验数据的处理,.,16,Patch
8、clamp training class,Apr. 23-25, 2014,三、滤波,信号采集前的滤波 全细胞通道电流记录：1-2 kHz 全细胞突触活动记录：10 kHz 单通道电流记录：10 kHz 动作电位记录：10 kHz,膜片钳实验数据的处理,.,17,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,信号采集后的滤波,膜片钳实验数据的处理,.,18,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Lowpass,Highpass,Bandpass,Notch,Electrical Interference
9、,Clampfit滤波类型,膜片钳实验数据的处理,.,19,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Lowpass 最为常用。 Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示在该框底部。 7种类型： （1）8-pole Bessel：数据失真小，普遍用于时域数据。 （2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前后一些数据点（取决于Smoothing points，取3-99中的奇数）的平均值赋予当前数据点，完成滤波。 Smoothing points值越大，数据幅度削减越大。 （3）Gaussian：
10、数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均值中所占的比例较大。 （4）RC (8-coincident-pole)：用于时域数据。 （5）RC ( single-pole)：用于时域数据。 （6）8-pole Butterworth：用于频域数据。 （7）8-pole Chebyshev：用于频域数据。,膜片钳实验数据的处理,.,20,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Lowpass滤波,.,21,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Highp
11、ass 又称交流耦合（AC Coupling），可削弱低频信号而通过高频信号。 Clampfit提供两种：8-pole Bessel，单极RC 采用- f-3dB ，Clampfit自动计算出f-3dB范围并显示在该框底部。 最常见的是在神经元上进行细胞内记录时使用高通滤波器，它可降低膜电位的低频振荡对突触电流的干扰。,膜片钳实验数据的处理,.,22,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Highpass滤波,.,23,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 201
12、4,Bandpass 相当于低通滤波与高通滤波的交叉，需要同时设定高通滤波与低通滤波。 高通滤波的f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB 。 带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时，对其它频率的噪声进行滤波。,膜片钳实验数据的处理,.,24,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Notch 带阻滤波：削弱某一特定频率（如50 Hz交流）信号。 中心频率（Center frequency）：10-3,000 Hz。 频率宽度（3dB width）：频率宽度。 -3dB width越窄，滤波需要的数据点越多，滤波效果越好。,膜片钳实验数据的处
13、理,.,25,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Notch滤波,.,26,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Electrical Interference（EI） 电干扰滤波器（Electrical interference filter, EI）为数码滤波器。 可同时去除50 Hz及其谐波（100 Hz、150 Hz等）的复杂交流噪声。 Harmonics from 1 to：用于设定欲去除的交流谐波的最高数目，最大数目为20（对应于1 kHz
14、），一般去除第1-3个就够了。 Cycles to average：数目越大，-3dB频率宽度越窄，滤波效果越好，但需时越长。 Reference frequency：选50 Hz。,膜片钳实验数据的处理,.,27,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,EI所需最少数据点的计算举例 滤波器所需最少数据点 （采样频率/ 50 Hz） Cycles to average 若采样频率 10 kHz， 则一个50 Hz正弦波周期的采样点数 10 kHz / 50 200 点 若设定Cycles to average 10，则需要的最少采样点数 2,00
15、0点 采样数据点不够的话，将不能清除谐波干扰。,膜片钳实验数据的处理,.,28,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,四、数据文件内部/之间的数学运算,Analyze/Average Traces 平均文件内任意几条相同的Trace，获得平均后的一条Trace。 要求： Clampex软件的Fixed-length events、Episodic stimulation和High-speed oscilloscope模式。 重复记录的信号，时程必须固定不变。,膜片钳实验数据的处理,.,29,Patch clamp training class,
16、Apr. 23-25, 2014,降低信号噪声 信号频率谱与噪声频率谱一致或有重叠时，滤波不行。 平均Trace的原理：设有N条Trace，则（见表）： 先累加所有N条Trace， 此时信号幅度增大为原来的N倍，而噪声却只增大为原来的N倍。 然后再除以Trace条数N， 信号幅度不发生大的变化，而噪声幅度却降低为原来的1/N。,膜片钳实验数据的处理,.,30,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Average Traces功能,.,31,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Analyze/Segmented Average 可对几个Trace中的某一相同时段（如Epoch A）或Cursor 1-2之间的时间段进行平均，平均后的文件通常用于Analyze/Subtract
