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1、综合性实验二 质粒DNA小量制备和电泳鉴定,一实验目的,1掌握碱变性裂解法制备质粒DNA的原理。 2了解质粒DNA的性质和用途。 3. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。 4. 掌握质粒DNA（闭环和开环构型）的电泳分离鉴定。,质粒 plasmid,质粒是细菌染色体外的环形双链DNA分子，能在宿主细胞内独立自主的进行复制。,质粒,基因工程中目的基因的运载工具。,质粒载体,大小可从1kb到200kb,筛选标记 多克隆位点 酶切位点 复制原点,质粒的应用,质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。,大多数来自细菌的质粒是
2、双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。,Visualization of topoisomers. In this experiment, all DNA molecules have the same number of base pairs but exhibit some range in the degree of supercoiling. Because supercoiled DNA molecules are more compact than relaxed molecules, they migrate more rapidly during gel electrop
3、horesis.,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 因此该凝胶适合于核酸与核蛋白、免疫复合物的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中也常用于LDH、CK等同工酶的检测。, 影响电泳迁移率的因素：,Friction,Charge,外加电流、电压,分子量 分子形状,分子的等电点,Voltage,CATHODE,ANODE,+,-,琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术,在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比； 分子构型也对
4、迁移率有影响，如共价闭环DNA直线DNA开环双链DNA。 当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。,差速离心DIFFERENTIAL CENTRIFUGATION,离心:利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开 。,二实验原理,质粒提取原理,质粒提取有多种方法，但都包含三个基本步骤：,1. 培养细菌使质粒扩增 2. 收集裂解细菌 3. 分离纯化质粒DNA,去除蛋白质,去除RNA,去除基因组DNA,苯酚-氯仿抽提法,
5、Rnase消化法,？,质粒DNA和基因组DNA的区别,大小不同 变性与复性有差异,质粒DNA较小，通常只有基因组DNA分子量的百分之一。 基因组DNA容易断裂线性化。,从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的有： 依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点选择。 碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。,分离质粒DNA和基因组DNA的方法,碱变性法 煮沸法 羟基磷灰石层析法等,碱裂解法提取质粒的原理,应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。,原理： 1. 强碱NaOH和SDS裂解细菌，细菌中
6、的质粒DNA和基因组DNA在强碱条件下发生变性。 2. 怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，而染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以复性，并形成沉淀，经过离心随细胞碎片一起去除。 3. 怎样去除蛋白质？ 留有质粒DNA的上清，经酚/氯仿去除蛋白质后，用乙醇沉淀DNA，即得到质粒DNA。,三、试剂与仪器,Biospin质粒DNA小量提取试剂盒： Resuspension buffer, Lysis buffer, Neutralization buffer, wash buffer, Elution buffer, RNase solution, Spin
7、 columns.,琼脂糖凝胶电泳： 电泳仪，电泳槽，紫外灯 琼脂糖，50XTAE电泳缓冲液，6X点样缓冲液，DNA Marker，溴化乙啶（荧光染料，结合DNA并在紫外线下显示）,四、操作步骤,Resuspension Buffer 细胞悬浮液,Lysis Buffer 碱裂解液,Neutralization Buffer 中和液,Spin column 吸附柱,Wash Buffer 漂洗液,Elution Buffer 洗脱缓冲液,2. 质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳,1) 用胶带将洗净、干燥的配胶板的边缘封住，形成一个胶模并水平放置，放入电泳梳。,2) 按水平板的长宽0.5cm胶厚，量取
8、1TAE，并按0.8的浓度称取琼脂糖（agarose），在微波炉或电炉上加热至全熔（清澈透明）。,3) 等凝胶温度降至大约5060以下时，加入1 mg/L溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5g/mL ；摇匀并轻快地倒入水平板中，除掉气泡。,4) 凝固后，将梳子轻轻拔出。 5) 去掉胶带，将水平板放入加有1TAE电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。,6) 上样Buffer 和DNA 混匀后点样，记录点样次序。 7) 在水平板两边的点样孔中分别加入marker即分子量标记。 8) 盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（5V/cm）及电泳方向(DNA阴极阳极），开始电泳。 9) 当色素接近胶的尾端，停止电泳，样品在紫外灯下观察、成像。,五、结果,Marker,质粒DNA,
