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1、血清总蛋白、白蛋白测定 （Serum total protein、Albumin test）,临床生物化学： 是研究机体健康和疾病的生物化学过程。测定体液或组织中的成份以提供对疾病的诊断、治疗和预防。,所用样品： 血液（血清/血浆）、尿液、脑脊液及体液,测定方法： 凯氏定氮法、双缩脲法、酚 试剂法、紫外分光光度法、染料 结合法、比浊法等。,（二）、 双缩脲法 蛋白质中的肽键在碱性环境中能与铜离子作用产生紫红色络合物。此反应和2个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性环境中与铜离子作用产生紫红色络合物的反应相似，故称为双缩脲反应。,简单、精密、准确，为临床首选的常规方法，但灵敏度稍差。,（三）、 酚试
2、剂法 运用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基能还原磷钨酸-磷钼酸试剂生成钼蓝来测定蛋白质的浓度。 改良法：在酚试剂中加入碱性铜离子。集中了双缩脲法和酚试剂法的优点,灵敏度高，但受许多还原物质的干扰，限制了它在临床上的应用。,（四）、 紫外分光光度法 蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处有一吸收峰，可用于蛋白质含量的测定。,准确性差，但因未加任何试剂和处理，可保留其生物活性且可回收全部蛋白质，故可用于较纯的酶和免疫球蛋白测定。,（五） 染料结合法 在酸性环境下，蛋白质分子带正电，可与带负电的染料结合产生颜色而测定之。 重复性好、灵敏度高，BCG 法特异性不高。,（六） 比浊法 某些酸（如三
3、氯醋酸、磺基水杨酸）能与蛋白质结合产生微细沉淀，测定悬浮液的浊度即可求得蛋白质的含量。 简单、试剂易得，但影响因素太多。,血清总蛋白双缩脲测定法 一、原理：蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性环境中能与铜离子作用产生紫红色络合物。,此反应和2个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性环境中与铜离子作用产生紫红色络合物的反应相似，故称为双缩脲反应。,颜色的深浅在一定浓度范围内与蛋白质含量成正比，经与同样处理的蛋白标准液比较，即可求得蛋白质含量,郎伯-比耳定律： 溶液的吸光度与溶液浓度成正比 A1 = lgI0 / I = K1C1L1， A2 = lgI0 / I =
4、 K2C2L2,由于 分析物质相同，处理一样，比色皿也相同， 故 A1 / A2 = C1 / C2， 则 C1 = C2,A1,A2,二、主要试剂： 双缩脲试剂（ NaOH 、硫酸铜、 酒石酸钾钠、碘化钾） 蛋白标准（60 g/L）,三、操作步骤 加入物（ml） B S2 U2 血清 / / 0.05 标准液 / 0.05 / 双缩脲试剂 3.0 3.0 3.0 混匀，37，10分钟，540nm处比色，1cm光径比色杯，B管调零,注： 1.非严重黄疸、脂血及高脂血 症血清不用做血清自身对照管。 2.可以用蒸馏水调零，目的是检 验各个试剂的好坏,四、结果 Au 血清总蛋白（g/L） = X 6
5、0 As 五、正常参考范围 60-80g/L,六、临床意义 1、 总蛋白浓度升高 （1）蛋白质合成增加：大多见于多发性 骨髓瘤患者 （2）血浆浓缩，如急性失水、外伤性休 克、慢性肾上腺皮质功能减退。,2、 总蛋白浓度降低 （1）蛋白质合成障碍：肝功能严重受 损蛋白质合成减少 （2）蛋白质丢失增加：严重烧伤、大 出血、肾病综合征、溃疡性结肠炎 （3）营养不良或消耗增加：营养失调、 低蛋白饮食；患消耗性疾病 （4）血浆稀释：如静脉注射过多低渗 溶液或各种原因引起的水钠潴留。,七、注意事项 1、 黄疸血清、严重溶血、某些试 剂（如葡萄糖、酚酞、溴磺酞 钠）对本法有明显干扰，可用 标本空白管来消除。
6、2、 高脂血症混浊血清也会干扰比 色，先用丙酮抽脂后再做。,八、方法学评价 准确性高 重复性好 优点 干扰少 试剂稳定 操作简便、快速 缺点 灵敏度较低 手工和自动化都可，已被推荐 为测定血清总蛋白的参考方法。,白蛋白测定 白蛋白是血浆中含量最多的蛋白质。其测定方法主要有盐析法、电泳法、染料结合法、免疫法等。,（一）、盐析法 蛋白质分子表面因有水化膜的保护而稳定，如果加入大量中性盐则电荷被中和、水化膜被破坏，蛋白质分子因相互聚积而沉淀析出，此种现象称为盐析。,球蛋白分子量较白蛋白大，相等重量的表面积要小，电荷和水化膜也少，故先被沉淀下来，而白蛋白仍留在溶液中，可用测定总蛋白的方法测定之。,常用
7、的中性盐有半饱和硫酸铵、23%硫酸钠、双硫酸（20.8%硫酸钠和7.0% 亚硫酸钠溶液） 准确性差、操作烦琐，且不宜用自动生化分析，基本不用。,（二）电泳法 醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳。 特异性高，准确性不够，操作烦琐费时，且不宜用自动生化分析,（三）染料结合法 根据白蛋白结合外源性染料的能力比球蛋白大，故在不分离白、球蛋白的条件下用染料直接测定白蛋白。 有干扰，但灵敏度高、操作简便、重复性好，自动生化分析仪常用的方法。,（四）免疫学法 免疫扩散法、免疫比浊法（透射比浊法和散射比浊法）、放射免疫法。 特异性好、灵敏度高，但成本较高，费时，一般用于尿液和脑脊液中微量白蛋白的测定。,溴甲酚紫
8、测定血清白蛋白 一、原理：在pH5.2的缓冲液及表面活性剂存在下，溴甲酚紫（BCP）可与白蛋白结合形成绿色复合物，在603nm波长处有一吸收峰，与同样处理的白蛋白标准比较，便可计算血清中的白蛋白浓度。,二、 主要试剂： BCP 乙酸钠 用乙酸调pH 乙醇 至5.20 Brij-35 白蛋白标准：40g/L,三、操作步骤 加入物（ml） B S2 U2 血清 / / 0.02 标准液 / 0.02 / BCP试剂 3.0 3.0 3.0 混匀，1min后在603nm处比色，B管调零,四、结果 Au 血清白蛋白（g/L）= 40 As 五、正常参考范围 成人36-46g/L,六、临床意义 1、 增
9、高：见于严重脱水所致的血浆浓缩 2、 降低： (1) 急性降低：见于大出血和严重烧伤； (2) 慢性降低：见于肾病蛋白尿、肝功能 受损、恶性肿瘤、结核病伴慢性出 血、营养不良等。 （血清白蛋白低于20g/L，临床上出现 水肿）,七、注意事项 1、 严重脂肪浑浊血清对测定有干 扰，应做自身对照。 2、 严格控制pH5.20.03 （球蛋白和球蛋白的等电点 接近5.20） 3、不可用动物血清作质控血清,八、 方法学评价 特异性高、反应简便、快速、完全，干扰少（相对于BCG法）,小结： 凯氏定氮法是蛋白质测定的参考方法，用来标化血清和检验其他测定蛋白质的方法；双缩脲法也是测定血清蛋白质的参考方法，同时，也是临床上最常用的常规方法。,BCP法测血清白蛋白特异性高、反应简便、快速、完全，但不可用动物血清作质控血清；BCG法测血清白蛋白简便、快速、干扰少，是目前国内测血清白蛋白的最常用方法，但特异性不高（30S内对白蛋白特异）。,
