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1、毕业论文实验方案 题目：淀粉降解菌合成学校：上饶师范学院班级：12生科2班专业：生物技术一 材料与方法1.1 材料与仪器 1.1.1 筛选样品 实验用土壤污泥。1.1.2 培养基目的菌培养基：淀粉，牛肉浸膏0.1g/L；蛋白胨0.1g/L, NaH2PO4 3.5g/L； K2HPO4 2 g/L MgSO4 0.2g/L CaCl2 0.1 g/LMH4Cl 1g/L 琼脂1.5g/100mL；尼罗蓝染 色剂0.5g/10g/l；各种生长因子及无机盐离子；尿素0.1g/l；pH值为7合成培养基：淀粉 ；尿素 (不同含量)， pH值为71.1.3 实验仪器烧瓶恒温摇床（ZHWY-2112B）培
2、养皿 试管夹 烧瓶 移液管1.2实验方法 1.2.1 目的菌富集、纯化 将5g样品（土壤污泥）加入装有150mL富集培 养基的500mL的三角瓶中， 30时，摇床培养24h后，吸取 1mL富集液后分别用培养基筛选稀释10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5， 分别进行涂布， 30恒温培养24h，反复摇床3次，挑取单个菌落于牛肉膏 蛋白胨斜面培养基上进行纯化培养， 30培养24h，对生长 菌进行镜检，获得单菌落。用0.5%的尼罗蓝染色剂进行染色 处理，10min后，用水洗净染色剂并用滤纸吸干水分。1.2.2 产PHA菌株筛选初筛:生物脂肪大多是以脂肪颗粒的形式存在的，可被苏丹黑
3、B 染成蓝黑色的脂肪粒，是筛选 产脂肪菌株较为理想的方法。将上述得到的纯培养菌株转接到发酵培养基中，37，150 r/min 振 荡培养 36 h 后，5000 r/min 离心 10 min，弃上清液。 ，将分离后得到的菌体用 0. 3% (m /v) 苏丹黑 B 染色 15 min，倾去染色液，二甲苯冲洗至 洗脱液无色，再用 0. 5% (m /v) 蕃红复染 10 s，去离 子水冲洗、吸干后镜检，定性检查有无蓝黑色的脂肪 颗粒为标准进行初筛。 复筛:分别取两环 Stoke 斜面培养基上活化 了的初筛获得的菌株，放入 80 mL 种子培养基中， 37，150 r/min 振荡培养 36 h
4、。取此培养液 2 mL 转接于装有 80 mL 发酵培养基的三角瓶中，同上述 条件培养 36 h。从发酵液中提取 PHA 并测定其含量，进行复筛。1.2.3 菌株个体形态观察、革兰氏染色1.在显微镜下观察；1.将细菌染色2.将染色后的细菌至于载玻片上,盖上盖玻片,至于显微镜下,在低倍镜中找到细菌,并将其移到视野中央（此时看到的只是一块一块的,并非单个细菌,要想看到单个细菌形态需要增加放大倍数）3.再换用高倍镜观察,用细准焦螺旋调节至视野清晰即可观察 2.革兰氏染色法：原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且
5、交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色.1.2.4 PHA提取筛选得到的PHA合成菌接种于液体培养基，培养48h 后，培养液3500r/min离心处理30min，将离心沉淀物冷冻 干燥10h，然后沸水浴30min，反复冻融3次。将冻融破壁后 的沉淀物置于研钵中
6、加入4冷丙酮研磨30min，过滤；滤 渣用50热氯仿浸提3次，每次8h；过滤后合并浸提液，旋 转蒸发浓缩至5mL，加入甲醇（-20）200mL，静置过夜得 PHA粗品，重复氯仿溶解甲醇沉淀2次，沉淀物50干燥， 得到PHA精制品。2.实验结果与讨论2.1 产PHA菌株的筛选 紫外灯下，由尼罗兰平板上挑取具有荧光的菌落，以 苏丹黑染色，初筛得到5株PHA合成能力的菌株。初选得到 的5株菌进行摇瓶发酵，利用细胞干重或含荧光含量来测定各菌株产PHA含量。2.2 PHA菌株生长特性研究 由上述测定5株菌PHA产量，选择最优菌株作为目的菌株进行进一 步研究。2.2.1 培养温度对优菌株生长的影响 分别在
7、不同温度（24、26、28、30、32、）条件下，三角瓶摇床振荡培养优菌种，pH值为7，装液 量100mL/500mL，摇床转速100r/min，培养时间24h后测定 PHA含量，记录结果。温度c细胞干重g2.2.2 初始pH值对优菌种生长的影响分别在不同pH值（ 5、 6、 7、 8、 9）条件下， 28摇瓶振 荡培养24h，装液量100mL/500mL，摇床转速100r/min，测定PHA含量， 适宜生长pH值是指菌体分裂代时最短或生长率最高 时的pH值，此pH值条件下能获得最大的细胞量，同时此 条件下，生长的有关酶的活性最好。2.2.3 培养基含量对菌种生长的影响 分别选用50ml.100ml.150mL.200ml的培养基含量来检测菌种生长的影响，并记录菌株数量，记录不同培养基含量的菌种生长情况。3.分析结果得出结论。
