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1、新浪微博analysisDMPK 2014-12,体内药物分析 Biopharmaceutical Analysis; Biomedical Analysis,乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）,用法用量： 口服。成人常用量： 支气管感染、肺部感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，疗程7-14日。 急性单纯性下尿路感染：一次1片，一日2次，疗程57日；复杂性尿路感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，疗程1014日。 细菌性前列腺炎：一次2片，一日2次，疗程6周。,0.3-0.4g/日,0.2g/日,0.4g/日,抗菌药物的抗菌活性,药物抑制或者杀灭病原菌的能力 最低抑菌浓度（m
2、inimum inhibitory concentration）抑制培养基内细菌生长的最低浓度。MIC 最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration）杀灭培养基内99.9%的微生物。MBC 喹诺酮类药物对致病菌的杀菌作用取决于药物血药浓度的峰浓度，即药物浓度越高，杀菌作用越强。浓度依赖性 时间依赖性杀菌活性与药物浓度维持在MIC以上时间的长短有关。-内酰胺类、林可霉素类等抗生素。,乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）,用法用量： 口服。成人常用量： 支气管感染、肺部感染： 药物随着血液到各个组织 急性单纯性下尿路感染： 药物通过尿液排泄在下尿路发挥治疗作用 细菌
3、性前列腺炎： 药物随着血液到前列腺组织,0.3-0.4g/日,0.2g/日,0.4g/日,测定血液、尿液甚至组织中的药物浓度,体内药物分析,成分复杂 干扰众多 浓度很低 高灵敏度 高选择性的方法,1.2体内药物分析对象和待测物特点,成分复杂、干扰众多 生物基质的干扰蛋白质、糖、脂肪、离子 其他药物的干扰卡马西平治疗癫痫的有效血药浓度为38g/ml，潜在中毒浓度为12 g/ml。病人可能之前用过其他抗癫痫药物如丙戊酸钠、乙琥胺等。 代谢产物与原型药物互相干扰抗抑郁药米氮平,DMR,8-OHM,N-O-MRT,方法选择性要高,体内药物分析对象和待测物特点,采样量小，浓度很低 常见的生物样品 采样量
4、少，特定条件采集，不易重新获得 血浆：人13ml；犬15ml；大鼠0.30.5ml 浓度为ng/mlg/ml 数量级,血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液等均匀生物样品 心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀生物样品,方法灵敏度要高,1.3 体内药物分析方法的特点,对分析方法的要求高：满足灵敏度及专属性的要求 样品需要经过前处理，才能分析 分析工作量大，方法验证要求严格，测试数据处理和结果阐明较为复杂,1.概述,1.4体内药物分析的任务,定性分析药物代谢产物、内源性物质是什么 定量分析血浆、组织、尿液药物及代谢物浓度 药物代谢与动力学（drug metabolism and pha
5、rmacokinetics，DMPK）研究新药研发 治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）临床应用 内源性物质检测疾病标志物 社会事件中的分析食品安全、法医毒物分析等,1.概述,体内药物分析的任务：DMPK,药代动力学研究涉及药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄等动态过程，需要研究血药/组织浓度时间曲线的变化，探讨药物分布与药理作用的关系。,1,2 Stability + Solubility 3 Passive + Active Trans. 4 Pgp efflux + CYP 3A4 5- Hepatic first pass effect,药物代谢
6、与动力学,血药浓度-时间曲线 尿药累积排泄曲线 生物等效性评价 绝对生物利用度 相对生物利用度 代谢途径 代谢酶 ,体内药物分析的任务：TDM,TDM即测定血液中或其它体液中药物浓度，观察临床药物反应，考察药物治疗效果，必要时根据药动学原理调整给药方案。方向是实现个体化给药，目的为临床合理用药服务，达到最佳的药物治疗效果。,治疗药物监测,抗癫痫药苯妥英钠血药浓度与药理作用及毒性反应,患者女性，25岁，因癫痫强直阵挛性发作入院，遂静脉注射负荷剂量苯妥英钠800mg并开始口服维持剂量250mg/d。测得苯妥英钠的浓度为 3.6 g/ml，医生考虑到尚未达到治疗浓度范围，故增加剂量到400mg/d。
7、患者出现痉挛等类似癫痫发作症状。测得血药浓度为10.9g/ml，医生拟打算再次增加剂量。,患者白蛋白为20g/L(正常范围是3448g/L)，于是建议检查患者游离苯妥英钠浓度。结果显示游离苯妥英钠浓度为4.9 g/ml（游离药物治疗浓度范围12 g/ml ），判定患者苯妥英钠中毒，建议降低剂量为250mg/d。,体内药物分析的任务：内源性物质检测,体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等。 机体正常生理条件或机体发生病变：测定体内内源性物质或疾病标志物的含量，疾病的辅助诊断或及早预防。 药物（中药）代谢组学研究,体内药物分析的中心任务,体内药物分析方法学研究 生物样品预处理方
8、法 分离分析实验条件的优化选择 考察体内分析方法的灵敏度、专属性、准确度、线性范围等 为临床药理学、临床药学等相关学科提供专一、灵敏、准确、快速、简便的体内药物分析方法。,2.1体内样品的种类与采集,血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液等均匀生物样品 心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀生物样品 样品选取原则 （1）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系； （2）易于获得； （3）便于处理，适合于分析； （4）根据不同目的与要求进行选取。,2.体内样品的种类、采集与贮存,体内样品种类与采集,血液,自然凝结,加抗凝剂,离心,离心,全血,上层：血清serum（比血浆少纤维蛋白原）（4
9、0%）,下层：血细胞（凝块）,上层：血浆 plasma（50%）,下层：血细胞,血样Blood,一般在给药后的不同时间点采集血样,体内样品种类与采集,尿样Urine 特点：尿药浓度通常变化较大；尿药大多呈结合状态。 优点：易得，且样品量多；正常尿液仅含微量蛋白。 缺点：尿液是一种良好的细菌培养基；尿液中多具有紫外吸收的化合物。,一般在给药后的不同时间段收集尿样,体内样品种类与采集,唾液Saliva 优点：非伤害性采样，且不受时间地 点限制。 缺点1：唾液药浓一般低于血浆药浓； 某些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓（UP）十分接近，但两者相关系数不明确； pH改变会影响弱酸性和弱碱性药物在唾液
10、中的药物浓度 。,一般自然采集或刺激采集，量少,体内样品的种类与采集,组织tissue 指各种体内脏器，需要对其进行均匀化制备，使之成匀浆溶液 反应药物在脏器的分布与蓄积情况 头发hair 取样方便，可以获得长期的用药史信息 前处理复杂，需要排除头发表面的各种干扰,2.2 体内样品贮存与处理,室温放置时间 短期保存温度与时间 长期保存温度与时间 -20、-40、-80 分装保存便于测定 去活性保存防止酶降解,保存温度与时间由 什么决定？,2.体内样品的种类、采集与贮存,研究维生素C泡腾片进入人体后血药浓度-时间曲线变化，通过测定给药后人血浆中维生素C实现。问：采集血样之后如何保存？,维生素C的
11、性质？,维生素C容易氧化，因此采集血样后加入抗氧剂保存。,3.1 体内药物分析的一般流程,血样 尿液 唾液 胆汁 组织器官,前处理方法 分离 纯化 浓集,样品测定 方法建立 方法优化,方法学研究 灵敏度 准确度 精密度 线性和范围 耐用性 ,灵敏、准确、快速、简便,3.体内药物分析方法的建立与评价,新药临床药物代谢动力学评价,新药I期临床试验阶段中进行药物在健康志愿者体内药物代谢动力学，探讨药物在体内吸收、分布和消除的特点，为II期临床实验的给药方案制定提供伦理依据。 研究内容包括健康受试者单次与多次给药的药物代谢动力学研究、饮食的影响、代谢产物的代谢动力学研究、药物-药物的代谢动力学相互作用
12、研究等。,体内药物分析方法是关键,人血浆中普卢利沙星活性代谢产物NM394的检测,羧基：酸性基团,哌嗪环：碱性、水溶性增加,共轭结构,分析方法建立,分析待测物NM394 分析目标建立分析方法可以专属、灵敏、准确的检测出血浆中NM394 HPLC法分离分析 选择内标化合物准确定量 选择前处理方法消除干扰、提高检测浓度,分析方法的建立色谱条件及优化,体外方法的建立 色谱柱：Diamonsil C18 柱 (5 m, 200mm4.6mm i.d.) 保护柱： DiamonsilTM ODS 流动相： 乙腈-0.5% 三乙胺（磷酸调pH3.0） 为21:79 流速： 1 ml/min 荧光检测：ex
13、 - 280 nm, em - 425 nm 柱温：30 内标化合物为洛美沙星（结构类似、性质相近）,分析方法的建立样品前处理,分析方法的优化必须考虑 生物样品的前处理的影响,？,3.2体内分析样品前处理,3.2.1 生物样品前处理的目的 纯化药物，消除干扰 净化 满足检测灵敏度的要求 富集 减少对分析仪器的污染 改善分析环境 除非生物样品基质不会干扰检测，也不会污染仪器，同时还有较好的灵敏度,3.体内药物分析方法的建立与评价,示例：血液中酒精的检测（直接测定）,顶空气相色谱火焰离子化检测器进行检测 0.2ml全血和0.5ml内标放到小瓶后迅速封口 小瓶被放到顶空进样器上 自动加热获得气液两相
14、平衡 将液上气体注入GC分析,3.2.2蛋白沉淀 protein precipitation PPT ,测定血样时用，去除蛋白质，使结合的药物释放出来 有机溶剂沉淀法（甲醇、乙腈） 中性盐析法（饱和硫酸铵） 强酸沉淀法（高氯酸）,使蛋白变性后除去,蛋白沉淀过程示意图,A B C D,A 血浆样品200l B 加入甲醇600l C 涡旋混合3min后 D 10000 rpm离心10min后,34,常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率,*：样品浑浊，妨碍准确测定,蛋白沉淀应用特点,确定沉淀剂与血浆的最佳比例 稀释倍数满足检测灵敏度的要求 尽可能多沉淀蛋白，减少对仪器的污染 适合浓度较高的血样 处
15、理过程快速，适合不稳定的药物测定,3.2.3液液萃取 liquid-liquid extraction LLE,常选择与水不混溶的有机溶剂，根据药物在水中与有机溶剂中的溶解度不同而将目标药物和干扰物质分开，随后浓缩含有目标药物的有机层,体液中内源性物质多为极性成分 药物多为亲脂性弱酸或弱碱,液液萃取示意图,取1ml血浆 置具塞玻璃离心管中,精密加入5ml 乙酸乙酯 提取溶剂,充分涡旋混合3min,液液萃取示意图,4000 rpm 离心10min后,准确取出上层有机溶剂置另一干净具塞玻璃离心管,置N2下水浴挥干溶剂 残留物用流动相溶解 离心后进样HPLC分析,便于纯化与富集,液液萃取应用特点,确
16、定合适的萃取溶剂 依据相似相溶原则 正己烷 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇 极性增大 有机相:水相=1:15:1,示例：尿液中甲基苯丙胺与苯丙胺的检测（液液萃取）,取尿液2ml，置于5ml离心管中，加入5ml 乙醚，涡旋，离心，取乙醚层置另一5ml离心管中，60度水浴氮气流下挥干 取尿液2ml，置于5ml离心管中，加入100l 0.1mol/l NaOH，混匀后加入5ml 乙醚，涡旋，离心，取乙醚层置另一5ml离心管中，60度水浴氮气流下挥干,甲基苯丙胺（冰毒）,苯丙胺,液液萃取应用特点,调节水相pH值 水相pH值主要由药物的pKa确定 碱性药物最佳pH值要高于pKa值1-2个pH单位 酸性药物则要低1-2个pH单位,pKa 9.9,pKa 10.1,酸化：0.1mol/l HCl 碱化：0.1mol/l NaOH,3.2.4. 固相萃取 soli
