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1、五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY 及 TVBMV 的多重RT-PCR同步检测,植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 41( 2): 146-153( 2011),介绍,烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus；TMV），又译为烟草花叶病毒，是一种RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，能使这些受感染的叶片看来斑驳污损 我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒( TMV) 、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病( PVY) 和烟草脉带花叶病( TVBMV) ，通常发生复合侵染。本研究对我国5 种烟草病毒的
2、外壳蛋白基因部分序列设计引物，建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 的多重RT-PCR 检测体系。对田间样品检测结果证明，多重RT-PCR 体系能够同时检测5 种病毒，并且灵敏度高,目前检测手段,目前检测烟草病毒的主要方法有电镜法、血清学鉴定以及PCR 技术。其中PCR 技术具有快速、便捷、灵敏度高和特异性强等显著优点。 多重RT-PCR技术：多重PCR 是在同一反应体系中加入两对以上特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应，具有高效性、系统性和经济简便性等特点，现在已应用于基因诊断和病原微生物的检测与鉴别。,检测步骤,11 病毒总RNA 的提取 TMV、CMV
3、、TEV、PVY 和TVBMV 核酸均为线状单链正义RNA。植物总RNA 的浓度及纯度是影响RT-PCR 检测的关键因素，其提取方法有十二烷基硫酸钠和硫氰酸胍抽提等，但是这些方法中提取缓冲液的配置操作繁琐，提取过程耗时长，容易造成总RNA 降解。为高效、快速提取植物总RNA，并对植物病毒进行PCR 检测，本研究用Biozol试剂盒提取烟草总RNA，并进行多重RT-PCR同时快速检测TMV、CMV 、TEV、PVY 和TVBMV等5 种主要烟草病毒,检测步骤,12引物的设计与筛选 应用Primer Premier 5 0 引物设计软件分别设计这5 种病毒的特异引物TMV cpF /TMV cpR
4、、CMV cpF /CMV cpR、TEV cpF /TEVcpR、PVY cpF /PVY cpR 和TVBMV cpF /TVBMVcpR。由于多重RT-PCR 要求在同一退火温度下同时扩增多个目的片断，因此对设计的大量引物进行筛选，选择Tm 值较一致的各对引物，以保证在同一退火温度下同时检测到TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 这5 种病毒,检测步骤,1.3 单重RT-PCR 用M-MLV 反转录酶反转录合成各病毒cDNA 第一链 25 L PCR 标准反应体系: 14 3 L ddH2O，2 5 L 10 PCR buffer 750 mmol /L Tris-HCl( pH
5、8 8) ，200 mmol /L ( NH4 ) 2SO4，0 1% Tween20，2 L 25 mmol /L MgCl2，2 L dNTP( 各2 5mmol /L) ，1 L 上游和下游引物混合物( 各10mol /L) ，0 2 L Taq DNA 聚合酶( 5 U /L) 和2 L cDNA 模板。PCR 反应循环参数: 94预变性3 min; 94变性30 s，48退火30 s，72延伸1 min，循环30 次; 72延伸10 min。取5 L PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较,单重RT-PCR电泳检测结果 以TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 5 种病 毒的反
6、转录产物作为PCR 反应的模板，经PCR 扩 增分别得到大小为237、273、347、456 和547 bp 的5 条特异性条带,检测步骤,1.4 多重RT-PCR 多重RT-PCR 反应体系: 取TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 5 种病毒的混合病株提取总RNA，反转录合成cDNA，将RT 产物随机混合作为多重RT-PCR 反应的模板，将各病毒特异性引物同时加入一个反应管进行PCR 反应。 退火温度分别选择42、45、48、51、54和57; 延伸时间分别为40、50、60、70、80 和90 s; 循环次数选择20、25、30、35、40 和45 个循环进行多重RT-PCR体系
7、优化,优化后的5 对引物比例为TMV CMV TEV PVY: TVBMV = 1.4 1 1 1 1.5，5 种模板的比例为TMV CMV TEV PVY TVBMV = 1 4 1 1 1 1 6。结果 显示，退火温度在48和51所获得的目的条带相对较好。延伸时间在60 和90 s 能获得理想的结果，而且40、50、70 和80 s 之间没有明显 的差别(,检测步骤,1. 6 PCR产物的克隆和测序 多重RT-PCR 扩增DNA 靶片段采用H.Q.Q.凝胶回收试剂盒回收纯化后，纯化的PCR 产物与pMD18-T simple vector 4 过夜连接，采用CaCl2 法制备大肠杆菌JM1
8、09 感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp 抗性和半乳糖苷酶的底物X-gal 进行蓝白斑筛选。阳性克隆经菌落PCR 和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒委托金思特科技( 南京) 有限公司测序。,病毒混合侵染烟草的检测,2007 2008 年对陕西泾阳、乾县等烟区进行采样调查，样品检测结果显示: 烟草花叶病毒( TMV)、黄瓜花叶病毒( CMV) 、烟草蚀纹病毒( TEV) 、马铃薯Y 病毒( PVY)和烟草脉带花叶病毒( TVBMV)都有发生，且多为复合侵染. 采集复合侵染的烟叶进行多重RT-PCR 检测，结果显示烟草中2 种、3 种和4 种病毒复合侵染都存在。,小结,一直
9、以来多重RT-PCR 灵敏度没有单重RT-PCR 高。本研究针对影响多重RT-PCR 的引物浓度、Mg2 + 浓度和退火温度等方面进行优化。研究发现，引物设计是多重RT-PCR 中非常关键的一步。引物的选择对实验的成败起着关键作用，既要使引物具有特异性，又要避免引物之间的相互影响，同时要尽量使各对引物的退火温度相一致。通过Blast 在线序列比对调整引物，使各条引物之间尽量不存在互补，有效减少了引物二聚体的存在。设计引物时使各对引物的Tm 值较一致，保证在同一退火温度下同时扩TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 5种病毒 DNA 扩增片段的大小是影响多重RT-PCR 的另一个重要因素，
10、若片段大小差别过大会影响到片段延伸时间的设定，因此本研究扩增5 个片段大小选择在200 500 bp 之间。由于多重RT-PCR 需要在同一体系中同时扩增出多条片段，扩增片段的大小存在差异，再加上不同引物的特异性程度不尽相同，因此引物浓度和模板的量是影响多重RTPCR的一个至关重要的因素，在建立多重RT-PCR体系的过程中需要对引物浓度和模板的量进行反复摸索，以获得一个最适量,THANKS,生技1102 黄雪婷,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,
