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1、血型分子诊断技术进展与应用,主要内容,红细胞血型系统分子诊断 红细胞血型系统分子基础 ABO血型系统 Rh血型系统 H血型系统(类孟买型) 红细胞血型系统分子诊断技术及其应用 小结,有关分子生物学概念,点突变 同义突变 无义突变 有义突变 起始密码突变 缺失 插入 重排,有关分子生物学概念,基因结构异常或表达异常 点突变 插入 缺失 易位和重排 拷贝数扩增 DNA多态性 基因的检测,常见突变示意图,ATG CGG TAG CGT AGT CTG ATG CGA TAG CGT AGT CTG ATA CGG TAG CGT AGT CTG ATG CGGG TAG CGT AGT CTG AT
2、G CG TAG CGT AGT CTG,新等位基因形成,红细胞血型系统,40个基因 1250个等位基因(截止2012年5月12日) 参见Blood Group Antigen Gene Mutation Database,红细胞血型分子机制,点突变 同义突变、无义突变、 有义突变、起始密码突变、拼接接受位点 插入 缺失 基因重组（RHD/RHCE） 基因部分重复 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.cgi?cmd=bgmut/systems,ABO血型分子生物学研究,1990年Yamamoto等首次克隆 基因定位于染色体9q34
3、 ABO基因cDNA，其分子量为41,000 Dalton，DNA长度为1062bp ABO血型系统为三复等位基因，有A、B、O三个基因 ABO基因包括7个外显子，长度大于18kb 大多数编码序列位于第6和7外显子,ABO基因示意图,常见等位基因,A和B基因 编码的蛋白都是353个氨基酸，O基因编码的蛋白只有 115个氨基酸 A101、A102、B101、O01、O02 A101作为参考序列 A102等位基因 C467T(Pro-Leu) B101基因在297、526、657、703、796、803、930、1096位有8个核苷酸与A101基因不同 但只有526、703、796、803四个核苷
4、酸的变化造成了氨基酸序列的变化（A101依次是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸和甘氨酸，B101依次是甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸和丙氨酸） O01基因在261位的G缺失,提前终止,ABO亚型频率分布,ABO血型中存在ABO亚型 临床输血和献血者检测中常见 440617份 A亚型22份 AxB 11例，AelB 3例，Ax 3例，Ael 2例，Amh 2例，A3 1例 B亚型41份 Bx11例，B39例，ABx7例，AB3 5例，Bel3例，Bm 2例，ABel 1例，ABend 1例，ABm 1例，Bend 1例。 B(A)1例 CisAB2例 A2 14例 A2B 35例 引自中国输血杂志2006，19（
5、1）：25,ABO亚型的分子研究,通过检测261、526、703、796、803位的核苷酸可以确认大多数典型的ABO血型的基因型 近年来对血清学分类的ABO血型亚型抗原，应用PCR、DNA测序等技术，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上进行研究 结果表明：原为同一亚型的抗原存在异质性，即血清学上同一亚型，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上有可能存在差异。 几个位点以外的核苷酸变化引起的ABO血型亚型常会引起检测结果的偏差 发现的等位基因数为290个（2012年05月22日）,A等位基因,可简要分为7大类等位基因 A1、A2、A3、Ax、Ael、Aw、Am A101等位基因序列作为参照标准 A102(
6、C467T)（在中国人群中比例大于A101) A103(C467T,C564T) A104(A297G) A105(A297G,B-O1重组) A106(B-O02重组) A205(A1009G ),B等位基因型,可简要分为5大类等位基因 B1、B3、Bx、Bel、Bw B等位基因中297、703、796、803位基本恒定 B101-B118 B101:A297G;C526G;C657T;G703A;C796A;G803C;G930A;G1096A B301-B308 B301:A297G,C526G,C657T,G703A,C796A, G803C, G930A, G1096A, C1054
7、T,O等位基因,O01O74 大多数261nt缺失，13个261nt不缺失 O01:261delG O02:261delG、T646A、G681T、C771T、G829A 人群中常见 003:261G、A297G,C526G,G802A O50,CisAB和B(A)等位基因,CisAB01-06 CisAB01:C467T,G803C CisAB02:C526G,C657T,G703A,G803C, B(A)01-06 B(A)型单克隆试剂应用于临床后，抗A试剂偶尔与原定为B型的红细胞发生反应，这类含有大量B抗原极少A抗原的红细胞称之为B(A)型 B(A)01:A297G,C526G, 796
8、A,G803C,G930A,G1096A B(A)02:A297G,C526G,C657T,C700G,G703A, C796A,G803C,G930A,G1096A,实验室发现的ABO等位基因,A208 allele* C467T; G539C A210 allele* 268TC;467CT A211 allele* 266CT;467CT B112 allele* 297AG; 526CG; 559CT;657CT; 703GA; 796CA; 803GC;930GA B305 allele* 297AG; 425TC; 526CG; 657CT; 703GA; 796CA; 803GC
9、; 930GA B307 allele* 297AG; 410CT; 526CG; 657CT; 703GA; 796CA; 803GC; 930GA Bw12 allele* C278T CisAB05 allele* A297G; C526G; C657T; G703A; C 796A; G930A O61 allele* 261del 743C,ABO基因诊断,PCR-SSP PCR-RFLP PCR-SSO PCR-SSCP PCR-SBT 261G干扰 正反定型不一致,ABO亚型分子机制和诊断,凝集强度改变 正反定型不一致 点突变为主 PCR-SSP 261G PCR-SBT SNP
10、(单核苷酸多态性),ABO亚型分子机制和诊断,PCR-SBT 常见为6-7外显子扩增 双向测序 存在风险：扩增引物SNP 多态性位点在其它位置 其它机制：表观遗传、其它,ABO亚型分子机制和诊断,PCR-SBT 1-7外显子扩增技术和策略 全长18kb 一般3对引物以上 外显子上的突变 ATG位置突变 其它机制？,ABO亚型分子机制和诊断,基层实验室如何有效获取信息 血清学结果 家系分析 保存抗凝全血-20以下 寻求分子诊断实验室帮助,Rh血型基因,基因位于1号染色体短臂上，即1P3436 两个基因：RHD编码D抗原，RHCE编码CcEe抗原 RHD和RHCE基因同源性高达96%以上 RHD和
11、RHCE基因均有10个外显子,RHD基因第1、2、8、10外显子的编码序列与RHCE的相对应序列相同 RHD基因第3、4、5、6和第9外显子序列与RHCE基因有区别 两个RH基因紧密连锁，相隔30000bp 两个基因的3末端面对面 两个基因之间有一个独立的基因SMP1 RHD和RHCE两个基因之间以及外侧分别有1个Rhesus盒 SMP1基因距中间一个Rhesus盒下游仅15bp,RHCE和RHD基因组成示意图,1p34-p36,Rh血型等位基因,RHAG RHD RHCE 突变和缺失、基因转换、基因重组 RHD 218 RHCE 104 RHAG 23,RHD等位基因,RhD阳性 正常RhD
12、阳性 弱D(weak D) 部分D(partial D) Del RhD阴性 RHD基因缺失 RHD基因功能丧失,部分弱D的分子突变点,RHD weak D type 1 T809G RHD weak D type 1.1 C5G; T809G RHD weak D type 2 G1154A RHD weak D type 3 C8G RHD weak D intron 55A intron3 5 G5A RHD weak D type33 (Taiwan1) G520A RHD weak D type Taiwan2 T809A RHD weak D type 51 A594T; C602
13、G RHD weak D type 52 92TC RHD weak D type 53 T740G 分子机制 碱基突变 缺失 mRNA拼接位点变异,部分D分子机制,Partial D 发现等位基因70多个 - RHD Va 2 T667G;G697C;G712A; G1273C RHD Va 3 G697A RHD Va 4 hybrid D(1-4) CE5 D(6-10) RHD VI type I hybrid (D1-3) CE(4, 5) D(6-10) RHD VI type II hybrid D(1-3) CE(4-6) D(7-10) RHD VI type III hyb
14、rid D(1, 2) CE(3-6) D(7-10) RHD VI type IV hybrid D1 Ce(2/3-5) D(6-10) 分子机制 基因交换RHD-CE-D 点突变,部分D分子机制示意图,Del分子机制,Del（D elution） 亚洲人群常见 RHD DEL (Cde)1 intron 3 G1A RHD DEL (Cde)2 G885T RHD DEL (Cde)3 intron 9 G1A; G1227A RHD DEL (Cde)4 intron 5 38delCTCT RHD DEL (Cde)5 1252insT RHD DEL (Cde)6 T1203A R
15、HD Del (Cde)7 G3A RHD Del (Cde)8 C28T RHD Del(Cde)9 T53C RHD Del(Cde)10 T251C RHD DEL T1222C RHD Del intron 8-9: del 1013 RHD DEL exon8 del 995nt including 3intron7+exon8+5intron8,RhD阴性的机制,不同Rh阴性表现型频率不同 RHD阴性的可能机制 RHD基因缺失 RHD基因发生改变 RHD-CE-D融合基因 RHD基因的第3到9外显子被RHCE基因取代 RHD阴性个体中约1/3具有完整的RHD基因 非洲D阴性个体具有
16、RHD（假基因）,RHCE等位基因,RHCE等位基因104个 正常RHCE RHce 48C RHCE G48C RHCE(1)D(2-10) RHCE(1)D(2-10) RHCE D-Chinese RH(D1-9CE10) RH(CE1 D2-7 CE8-10) hybrid CE(1)D(2-7) CE(8-10) RHCE 685-687del 685-687delAGA RHCE null amorph 2 Intron 4: G1T,9例弱D样本 RHD 845A 5例（RHD weak D type 15） RHD 1227A 3例（D-el (CDe); minimal expression of D antigen; ） RHD 1013C 1例（RHD weak D type 24） 10例部分D样本 Dva(Kou) 1例 Dva(Hus) 1例 DVa-like(YH) 1例 DVI type III 7例
