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1、细菌的耐药机理及检测方法西京医院检验科徐修礼 1 随着抗生素的广泛大量的滥用 介入性治疗 免疫抑制剂应用及某些基础疾病的发生 细菌性感染已是临床重要的常见病 且耐药性和耐药水平越来越高 给疾病的治疗及临床用药造成诸多困难 病原菌对常用抗生素 如 内酰胺类 氨基糖甙类和喹诺酮类药物的耐药性尤为突出 及时了解细菌的耐药机制和抗生素的发展及应用对策 对我们预防和治疗细菌性感染 制备新的抗菌药物及控制耐药性的蔓延是非常重要的 2 药物作用机制落后于细菌对抗生素耐药性传播的发展 药物作用机理主要是通过干扰细菌核酸的合成 抑制核糖体的功能 抑制胞壁的合成及叶酸盐的代谢等 细菌对抗生素的耐药机制包括遗传和生
2、化两种方式 遗传方式包括固有耐药 天然性 和染色体突变产生的耐药或获得新的DNA分子 生化方式是指细菌获得性耐药或质粒介导的耐药 主要包括 产生B 内酰胺酶 乙酰基转移酶 腺甘酸酶 磷酸化酶 拓扑异构酶等对药物的灭活作用 依靠菌膜的特性降低药物的通透性 改变抗生素作用的靶位 缩短与药物结合的时间 产生药物代谢的旁路 大量产生青霉素结合蛋白 PBPS 降低抗生素的新生力 发展产生耐受 产生抗生素导出泵 3 遗传方式 固有耐药固有耐药具有种属特异性 来源于该细菌固有的自然特性 即本身具有耐药基因存在染色体上 非发酵的G 杆菌如绿脓秆菌 醋酸钙不动杆菌 假单胞菌属及大多数G 杆菌耐万古霉素和甲氧西林
3、 肠球菌耐头孢菌素 厌氧菌耐氨基糖甙类药物等 这些菌的高度固有耐药性是由于菌体外膜的通透性低与继发的双重耐药机理 诱导产生头孢菌素酶和抗生素导出泵 导致的 4 染色体突变或获得新的DNA分子突变可发生于DNA分子 如结核杆菌的点突变可导致对利福平的耐药 淋球菌的点突变可导致对苯唑西林的耐药 也可发生于质粒和转座子的基因上 如质粒编码产生的超广谱B 内酰胺酶 ESBL 可能由于TEM和SHV酶基因的点突变导致的 这些点突变集中于基因的5个区域内 残基的突变能改变B 内酰胺酶与头孢菌素的结合形成 消除阻遏作用 导致抑制和水解三代头孢菌素 如果酶基因的连续突变可从本质上增强酶的活力 使新一代头孢菌素
4、灭活 某些DNA调节区基因的突变可产生头孢菌素酶导致对第三代头孢菌素耐药 5 耐药性可通过接合 转导和转化在微生物间传递 外源性相关的DNA小片段组合为内源性基因几乎都通过自然转化和重组形成 质粒接合传播的方式最普遍 但宿主范围局限 尚未发生可在G 和G 菌中都能复制的质粒 而转座子的宿主范围较广 可在G 和G 菌间转移 如染色体内的AmpC基因可通过转座子越位至质粒中 使某些细菌获得诱导产生能力极强的I型酶 称之为AmpC型ESBLS株 如肠球菌 克雷伯氏菌 某些肠杆菌科的细菌 是耐药性传播的重要原因之一 6 生化方式 细菌获得性耐药的生化机理主要有以下几种 1 酶的灭活作用通过水解或修饰作
5、用破坏抗生素的活性 1 内酰胺酶质粒介导或染色体突变使细菌产生 内酰胺酶 可水解破坏 内酰胺酶 使B 内酰胺类抗生素失活 这是大多数致病菌对此类抗生素产生耐药性的主要机制 目前B 内酶胺酶已有230余种 包括TEM系列酶 SHV系列酶 OXA系列酶 PSE系列酶 头孢菌素酶等 质粒介导的酶在G 菌中分布较广 以TEM 1最普遍 其次为OXA 1 7 根据分子量 等电点 被抑制谱 对底物的水解谱等将B 内酰胺酶又分为4类 类酶由染色体的AmpC基因诱导产生 多种需氧G 杆菌 如大肠杆菌 弗氏枸橼酸杆菌 阴沟杆菌等 可产生此酶 类酶临床上最为重要 分5个亚类 2a 2b 2b 2c 2d 2e 大
6、多数G 菌产生的酶 如pc1 属于2a亚类 2b亚类 如SHV 1 TEM 1 2b 亚类 如TEM 3 SHV 2 2c亚类 如PSE 1 PSE 4 2d亚类 如OXA 1和PSE 2 2e亚类 如FEC 1 少见 由大部分G 菌产生 随着新的 内酶胺类抗生素的临床应用 由大部分G 菌产生 8 随着新的 内酶胺类抗生素的临床应用 新的酶类不断产生 近年报道的ESBL可能来源于TEM和SHV酶 由于其有有序列的基因点突变导致的 该酶最早发现于肺炎克雷伯氏菌中 仅局限于少数肠杆菌和肠球菌中 可水解头孢菌素及单酰胺类抗生素 特别表现为相应的产酶菌对头孢噻肟 头孢他啶和氨曲南的耐药 并可引起对其氨
7、基糖甙类抗生素的耐药 9 新近研究发现 过量产TEM和SHV型酶的的细菌具有含锌的 内酶胺金属酶 此酶的催化效率极高 不仅存在于窄食假单胞菌中 也偶见于其它细菌 此酶对碳青霉烯类抗生素也有耐药性 且不易受酶抑制剂的影响 内酰胺酶阳性的嗜血杆菌属 淋球菌和卡他莫拉菌对青霉素 氨苄西林和阿莫西林耐药 内酰胺酶阳性的葡萄球菌和肠球菌对青霉素和乙酰氨基青霉素 羧基青霉素和脲基青霉素耐药 注 只对嗜血杆菌属 淋球菌 卡那莫拉菌 葡萄球菌和肠球菌测定 内酶胺酶 不要对肠杆菌科 假单胞菌属及其他需氧G 杆菌进行此试验 10 2 ESBLs1983年由khothe在德国发现 1985年正式报道 该酶为丝氨酸蛋
8、白酶的衍生物 它是由于 内酰胺酶上1 4位点氨基酸发生了突变 并可以通过质粒传播 由质粒介导的耐药比由染色体介导的耐药多 它可在不同菌株 菌种或菌属间转移扩散 突变产生的ESBLs抗药性广 且在ESBLS的质粒上常携带对其它抗生素如氨基糖苷类及氟喹诺酮类的耐药基因 呈多重耐药性 11 ESBLS的分类 根据酶的来源可分为TEM系列 为TEM1 TEM2的突变酶 此系列酶等电点一般介于5 1 6 5 绝大多数酶分子量 MW 为29KD 从TEM3起已发现有TEM 70 而且还在增加 SHV系列 此系列酶的等电点较高 介于7 0 8 2 分子量主要为29KD 从SHV 2起 现已发现SHV 12
9、非TEM和SHV系列 如确认为ESBLs菌株 不管体外药敏试验的结果如何 对所有青霉素类 头孢菌素类和氨曲南均应报告耐药 此酶对酶的抑制剂如克拉维酸 舒巴坦 他唑巴坦抑制 12 3 AmpC酶 1976年开始研究 但直到1990年由PaPaniColaoll等才首先证实了此酶的存在 由染色体介导的AmpC酶已发现50多种 基因带有调控序列 呈诱导型表达 酶的活性不被克拉维酸 EDTA抑制 可被邻氯西林 头孢西丁 BRL 42715 RO47 RO48等抑制剂抑制 携带染色体型AmPC基因的细菌主要有肠杆菌科 不动杆菌属 绿脓杆菌等 根据产酶水平的高低和表达方式可分为 野生型 通常所定义的Amp
10、C酶属于此型 基础型 低水平非诱导型表达 临床定义不大 如E Coli的染色体型AmpC酶 高诱导型 诱导后的产酶水平远高于野生型 去阻遏突变型 持续或半持续高水平产酶 13 由质粒介导的酶可分5 6组 弗氏枸橼酸杆菌组有LAT型和某些CMY型 肠杆菌属有MIR 1型和ACT 1型 摩根摩根组有DHA 1型和DHA 2型 气单胞菌组有MOX型 FOX型和其他CMY型等 质粒上的AmpC酶基因大小从7 180kb 酶分子大小约38 42KD 具有378 386个氨基酸 高产AmpC酶细菌通常对第四代头孢菌 如头孢吡肟 敏感 对碳青霉烯类敏感 对头霉素类 如头孢西汀 耐药 不被酶抑制剂所抑制 如果
11、分离的菌株对三代头孢菌素耐药 且不能被克拉维酸抑制 对泰能敏感 对头孢西汀耐药可初步推断为高产AmpC酶的细菌 14 4 氨基糖甙类灭活酶双功能的氨基糖甙类灭活酶 6 N 氨基糖甙类乙酰转移酶 2 O 氨基糖甙类磷酶转移酶 是葡萄球菌和肠球菌高水平耐氨基糖甙类药物的重要机制 此酶在分子不同的区域内存在两种不同的氨基糖甙改造因子 是由Th4100转座子内6 aac a 2 基因编码合成 该基因可插入R质粒及氨基糖甙类抗生素染色体基因中 导致在G 菌中氨基糖甙类抗性的快速传播 这种双功能酶与其它抗生素抗性因子无任何基因关联 真核蛋白激酶抑制剂能抑制磷酸转移酶的活性 提示这种双功能酶可能是蛋白质家族
12、中的两种普通结构 为临床提供开发这种功能酶抑制剂的可能 15 5 乙酰基转移酶某些细菌 如金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 肠球菌 肺炎球菌及流感嗜血杆菌等 对氯霉素耐药性主要是由于质粒编码产生的乙酰基转移酶所致 该酶使氯霉素转化为无活性的代谢产物 失去抗菌活性 16 6 拓扑异构酶该酶又称DNA旋转酶 由gyrA和gyrB编码 基因的突变引起靶酶DNA旋转酶的改变 使喹诺酮类药物失去抑制此酶的活性 而使细菌获得耐药 基因的突变常位于60 106残基区域内 在大肠杆菌中约为第83个丝氨酸 金黄色葡萄球菌中为第84个丝氨酸 17 2 菌膜通透性的改变由于药物的作用 细菌改变了外膜蛋白 使菌体外膜通透
13、性降低 阻碍抗生素进入细菌内膜靶位 外膜通透性降低主要由于膜孔蛋白缺陷 多向性突变 特异性通道的改变及膜脂质双层的改变 常见于假单胞菌 醋酸钙不动杆菌 肠球菌等对B 内酰胺类 氨基糖甙类 氯霉素 喹诺酮类抗生素的耐药 18 3 改变抗生素的作用靶位细菌在抗生素的作用下通过产生诱导酶对菌体成分进行化学修饰 使其与抗生素结合的有效部位变异 使药物不敏感 而细菌的生理功能正常 常见的药物有甲氧苄胺嘧啶 磺胺类 氨基糖甙类 氯霉素 喹诺酮类药物 如DNA中A位点基因的突变导致回旋改变造成喹诺酮类耐药 核糖体RNA甲基化抑制红霉素结合 PBP的改变导致对B 内酰胺类抗生素的耐药 PBP的改变主要有PBP
14、数量改变或缺失 药物与PBP的结合力降低 细菌产生诱导型PBP或缓慢结合的PBP 19 这种由PBP介导的耐药性在G 菌中较G 菌更常见 最常见于耐甲氧西林的葡萄球菌 主要与PBP2a的存在有关 该蛋白是一种转肽酶 负责细胞壁的合成 且由mecA基因编码 位于DNA外区域mec内 受质粒携带的blaRI blaI诱导抑制子及mecRI mecI基因所编码的蛋白质调控的 在抗生素的治疗中 mecA基因编码产生OXA系列酶 诱导表达产生大量的PBP 使药物不易与胞壁结合 导致药物的作用降低或失活 20 4 产生药物代谢的旁路抗生素可与靶位结合 但靶位的生理作用已被某种新生成份代替 如G 菌耐灰黄霉
15、素的机制可能与其产生旁路有关 21 5 产生耐受对 内酰胺类杀菌效应的耐受发生在抗生素低浓度时 细菌的生长状态被抑制 需很高浓度才能将其杀灭 呈最低仰菌与最低杀菌浓度分离 这是由于细菌过度分泌自溶抑制因子而降低了细菌的自溶性 这种耐受性表现为细菌虽不对B 内酰胺类抗生素耐药 但仍不被杀灭 致使抗生素治疗效果不佳 噬菌体可能与非耐受性转化有关 但其转染机理不明 22 6 产生导出泵导出泵的产生是受流出基因控制的 此基因存在于质粒上 在G 肠杆菌中该基因受抑制子调控 在G 菌中此基因受减毒机制调控 如G 菌对四环素的耐药性主要是导出泵的建立和核糖体的保护作用 至少有一种核糖体保护基因受减毒机制调控
16、 且其耐药流出基因可以在不同的细菌间传递 与核糖体保护性相关的基因既存在于质粒上 也存在于染色体的共轭转座子上 该转座子最初发现于链球菌中 可转染给其它G 菌 G 菌及支原体 四环素耐药基因和基因的刺激转导对其它受体菌来说具有双重效应 23 另外 G 杆菌导出泵的建立 易造成多重耐药 已发现旋转酶突变与导出性耐药机制共同存在 多重耐药机制在同一菌株中同时产生 容易产生对药物的高度耐药 7 超级整合子 基因盒 铜绿假单胞菌对碳青酶稀类的泵出机制 美平 泰能 MIC 1占17 6 国外15 35 超级整合子 耐药基因盒 10 26 24 耐药筛选 25 耐药筛选 26 细菌耐药的主要机制 抗生素靶位点改变 孔蛋白改变 细胞壁 膜通透性改变 超级整合子 基因盒 产生灭活酶 27 耐药细菌的扩散 敏感细菌 28 耐药细菌感染的后果 细菌耐药的直接后果增加患者住院时间与住院率增加死亡率增加感染发病率 MRSA VRE ESBL 增加医疗费用抗生素后时代间接后果无法治疗的感染对生产力损失估计美国每年损失 40亿美圆 29 关于药物的几个概念 1 抗感染药物 anti infectiveagents
