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1、第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛 作品名称： 新型果蔬农药残留生物降解剂 申报者姓名 （集体名称）： 何 玥 任珍珍 陈丽君 黄献培 类别：自然科学类学术论文哲学社会科学类社会调查报告和学术论文科技发明制作A类 科技发明制作B类报送方式：省级报送作品 高校直送作品35新型果蔬农药残留生物降解制剂作者：何玥 任珍珍 陈丽君 黄献培指导老师：钟国华 张木明自20世纪70年代以来，随着农药的大规模使用，农产品上的农药残留问题变得越来越严重(Ternan et al., 1998; Kolaczinskia, 2004)，探索出一条能高效治理农药残留的新途径就成为了现代科学工作者十分关注
2、的课题(Kitagawa et al, 2002;Horne et al., 2003; Grant et al., 2003; Kao et al., 2004)。许多学者认为，在解决业已存在的农产品农药残留方面，生物处理具有无可比拟的优势(De Lorenzo, 2001; Ohtsubo et al., 2003; Lee et al., 2004)。由于生物降解技术具有良好的发展前景，近年来国内外相关研究机构都加大力度研究开发新型的农药残留微生物降解制剂(Leng et al., 2003; Pieper et al., 2000, 2004)。而国内对农药微生物降解研究起步较晚，主要
3、集中在环境中农药残留生物降解菌的筛选、降解特性研究等基础层面，应用于农产品残留处理的研究则相对较少(程国锋等，1998；吴新杰等，2000；王兆守等，2003; 张久刚等，2006)，目前尚未见有成熟的产品应用，直接应用于农产品残留的甚至尚未见系统深入的报道。本产品应用了以生物修复（bioremediation）为理论基础的农药残留降解菌技术，通过筛选出既高效又对哺乳动物和环境友好的降解菌，开发形成了新型果蔬农药残留生物降解制剂。生物修复技术，即利用生物体（特别是微生物）的生命代谢活动来降低被污染环境中的有毒、有害物质的浓度或使其无害化，从而使污染的环境能够部分或完全地恢复到原初状态的过程(S
4、ogorb et al., 2002; Singh et al., 2006)。农药生物降解技术具有高效、无毒、无二次污染、经济实用、应用范围广的特点，且操作简便，具有极大的实用性和发展空间(DaSilva et al., 2002; Watanabe et al., 2003; Wu et al., 2006)。第一部分 生物降解制剂高效降解菌种的筛选1 材料与方法1.1 供试微生物从2004年1月开始，分别从贵州省遵义市鸡顶山取回贫营养土样和水样、中山凯达精细化工厂废水处理池中取回未处理污泥和废水样品，在培养基中添加拟毒死蜱和高效氯氰菊酯原药，自主分离筛选获得单一纯化真菌菌落，分别编号，测
5、定各菌种对农药的降解效能。取同等条件下农药降解率最高的菌株，进行分离培养和进一步研究。筛选获得的高效降解菌种采用液体石蜡保存法和砂土保存法保存。1.2 培养基种类的筛选将预培养3d的降解菌培养液于4800rpm离心10min，取0.1g湿菌体在无菌条件下分别接入装有50ml下述5种不同培养基的250ml三角瓶，置于气浴恒温振荡器中（28，150rpm）振荡培养5d后，将培养物用双层滤纸过滤，然后用蒸馏水清洗3遍，菌体连同滤纸干燥后称重，减去干燥滤纸质量，得菌体干重。以同等条件下菌丝体干重为指标，选择降解菌合适的培养基（方中达，1999）。1.3 降解菌分离筛选和形态及分子鉴定采用平板稀释法和富
6、集培养法分离纯化得到降解菌，测定菌种对高效氯氰菊酯和毒死蜱降解率，获得高效降解菌株(王兆守等, 2003)。参考文献王兆守等(2003)方法，利用HPLC法测定高效氯氰菊酯和毒死蜱残留量，计算菌株对供试药剂的降解率（）=（对照农药残留量处理农药残留量）/ 对照农药残留量100菌种的初步鉴定参考文献方法(方中达，1999；中国科学院中国孢子植物志编辑委员会，2003)及微生物教材，显微镜下观察各种降解真菌孢子、孢子囊、孢囊梗、分孢器等形态学特征，测量相关指标，根据初步形态观察，初步鉴定各种降解真菌归属。采用分子生物学的方法鉴定筛选所得菌种。抽提DNA，ITS扩增及产物割胶纯化，用pTA2载体克隆
7、该片段，挑单菌落培养后送去公司测序，分析测序结果。2 结果与分析2.1 降解菌株筛选结果采用筛选降解菌的平板稀释法和富集培养法，以高效氯氰菊酯和毒死蜱为唯一碳源的高效氯氰菊酯-毒死蜱-查彼氏培养基，从供试样品污泥中分离、筛选和纯化降解真菌菌株，初步分离纯化得到8个菌株能在培养基上生长，并利用HPLC分析测定8个降解真菌菌株对培养液终浓度为100mg/L高效氯氰菊酯和毒死蜱的降解率，结果表明，处理后24h，降解菌株01、02、03对高效氯氰菊酯的降解率分别为91.40、89.30和86.00，对毒死蜱的降解率分别为85.14、42.50和30.61（表1.1），对高效氯氰菊酯降解活性较高于对毒死
8、蜱。真菌菌株04 08处理后，对高效氯氰菊酯降解率分别为6277%，对毒死蜱降解率为1060%，DMRT法统计表明，菌株01对氯氰菊酯的降解效果最好，菌株02、03处理降解率显著高于其他真菌菌株，可进一步深入研究以证明其降解效果(表1.1), 其中菌株01对高效氯氰菊酯的降解液相色谱图（见图1.1）。图1.1菌株01降解高效氯氰菊酯HPLC色谱图24h (50mg/L)表1.1 降解菌对高效氯氰菊酯的初步筛选及鉴定结果 菌种编号干菌丝重(g)高效氯氰菊酯降解率(%)毒死蜱降解率(%)初步鉴定归属010.350.0093a91.400.26a85.141.02a枝孢霉属Cladosporium
9、sp.020.350.0058a89.300.55b74.201.81b曲霉属Aspergillus sp030.350.0033a86.000.81c42.502.50c曲霉属Aspergillus sp040.360.0067a77.500.47d30.614.01c曲霉属Aspergillus sp050.360.0145a73.800.40e20.133.62d青霉属Pinicielium sp060.370.0152a69.031.09f18.592.61d青霉属Pinicielium sp070.350.0120a66.400.21g14.801.09e曲霉属Aspergillus
10、 sp080.360.0108a62.500.40h10.653.24f木霉属Trichoderma spCK12.500.248.481.40(只有培养基,无菌)注：1)以上结果为3次重复平均值(标准误S.E.)。2)表中同列数据后标有相同字母者表示在5%水平差异不显著(DMRT法)。3)培养时间5d, 高效氯氰菊酯初始浓度为100mg/L。2.2 培养基种类的确定菌丝是降解菌降解农药的物质载体和桥梁。同种菌株在不同培养基中生长状况不同，菌丝体重等生长量可能呈现明显的差异。本文研究了高效降解菌01在查彼氏液体培养基等5种常用的液体培养基中的生长状况。将0.1g高效降解菌湿菌体分别接种于5种不
11、同的液体培养基中，置于气浴恒温振荡器(28，150rpm)振荡培养17d，准确称量37d的菌体干重(表1.2)。结果表明，降解菌在不同培养基中生长状况有所不同，菌丝体干重差异显著。从培养第3d起，查彼氏培养基中菌丝体生长最旺盛，均显著高于其他培养基同期生长量，到培养后5d菌丝体干重达0.4520 g/50mL，达到最高，显著高于其他培养基类型。确定以查彼氏培养基培养所筛选的高效降解菌株01。表1.2 不同培养基对降解菌菌丝体干重的影响培养基类型菌丝体干重(g/50mL)3d4d5d6d7dd查彼氏培养基0.28250.002a0.38690.002a0.45200.004a0.44580.00
12、2a0.43710.003a马铃薯葡萄糖培养基0.24070.004b0.34410.004b0.40410.006b0.42330.005b0.42300.006b燕麦片培养基0.24020.002c0.30130.003c0.36690.003c0.38200.002c0.38130.003c理查德培养基0.15740.006d0.19940.006d0.24360.008d0.27150.003d0.26460.005d玉米粉培养基0.00110.002e0.01980.003e0.03940.002e0.03980.002e0.04020.002e1)以上结果为3次重复平均值(标准误S
13、E)。连续培养7d.2)表中同列数据后标有相同字母者表示在5%水平差异不显著(DMRT法)。2.3 菌种鉴定菌株01是所筛选的高效降解菌株。该菌株在查彼氏培养基上菌落平展，新鲜菌落橄榄色，随生长时间的增加，菌落颜色逐渐加深，呈褐色至深黑褐色，绒状（图1.2和图1.3）。显微镜下观察可见分生孢子梗分化明显，单生或簇生，枝孢及分生孢子链生，枝孢01个隔膜，71823.5m，分生孢子无隔膜，4623m。PDA上25下黑暗培养，菌落榄绿色，反面黑绿色。分生孢子梗不分枝，直立。枝孢0-1个隔膜，52722.5mm。分生孢子顶生或侧生，椭圆形、柠檬形至近球形，淡榄色，无隔膜，一端或两端具孢脐，4823mm
14、。根据形态学观察，初步鉴定本菌株属于枝孢霉（Cladosporium sp.），编号为01。其他供试菌种归属见表1.1。 图1.2 查彼氏培养基培养降解真菌照片 图1.3 毒死蜱-高效氯氰菊酯-查彼氏培养基降解真菌照片抽提01菌株的DNA（图1.4），进行ITS扩增及产物割胶纯化，用pTA2载体克隆该片段，挑取单菌落培养后送去公司测序，结果表明，该序列共930bP, 将上面序列输入NCBI的vecscreen进行分析，去载体后得序列为589bp，将其BLAST。本菌与Cladosporium cladosporioides的形态基本相近，且ITS序列分析比较表明二者相似性高达99.8%，故将其
15、鉴定为Cladosporium cladosporioides (Fresen.) de Vries。图1.4 降解菌01的DNA凝胶电泳图第二部分 生物降解制剂的产品描述、生产过程与储藏在已经从环境中分离筛选出毒死蜱、氯氰菊酯新型高效降解菌株01的基础上，经过一系列研究，研制出生物降解制剂。由于技术保密，尚未申请发明专利，本发明作品在此仅作产品和生产过程描述（如果需要可以提供产品样品或进一步详情），较详细地介绍其储藏条件。1 产品储藏条件的研究1.1 方法 降解菌制成产品前必须在有效成分中加入不同保护剂、防腐剂，以保持降解活性的不变或基本稳定。根据降解菌的特性、经验和参考文献，选择高效、经济有利于该菌储藏的助剂，包括氯化钠、甘氨酸、苯甲酸钠、甘油、凯松等。
