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1、序号： 编码： 第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书 作品名称：灵芝gpd-Gl启动子功能活性分析 学校全称： 华南农业大学 申报者姓名 （集体名称）： 刘志明 李昭萍 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类 报送方式：省级报送作品高校直送作品说 明1.申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。
2、3.表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4.序号、编码由第九届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.522cm）。6作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。7.其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。A2申报者情况（集体项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写；2申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。申报者代表情况姓
3、名刘志明性别男出生年月1984年4月学校华南农业大学系别、专业、年级2003级食品学院生物工程（1）班学历本科学制4入学时间2003年9月作品名称灵芝gpd-Gl启动子功能活性分析毕业论文题目银耳芽孢电击转化体系的建立通讯地址华南农业大学华山宿舍24栋502房邮政编码510642办公电话13929547889常住地通讯地址广州市白云区增槎路榕桂街5号南栋西梯902B房邮政编码510165住宅电话13929547889其他作者情况姓 名性别年龄学历所在单位李昭萍女22本科2003级食品学院生物工程（一）班资格认定学校学籍管理部门意见以上作者是否为2006年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育
4、、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。是 否 （部门签章）年 月 日院系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果是 否负责人签名：年 月 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称作品分类（ D ）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（
5、包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路目的：食用菌具有与高等真核生物相似的蛋白质糖基化等翻译后加工模式，新型的生物合成能力和有效的分泌机制，能使人们得到大量生物活性蛋白。因此食用菌表达系统是目前较细菌和酵母更具优势的外源蛋白表达系统。但是，食用菌外源基因表达系统尚不完善，导致转化效率低，以及外源基因表达水平不高，主要原因之一就是缺乏有效的启动子。本作品的目的就是利用gfp报告基因，检测灵芝gpd-G1启动子的功能活性，以期获得功能活性强的启动子，为完善食用菌外源基因表达系统提供必要的顺式元件。基
6、本思路：本作品利用从灵芝（Ganoderma lucidum）菌丝体中克隆到的假定gpd-Gl启动子（gpd启动子是3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子）与gfp报告基因（绿色荧光蛋白基因）串连，构建成GFP蛋白表达载体pLBG。用PEG法介导的原生质体转化法将辅助质粒pCc1001（含trp1基因）和质粒pLBG（含灵芝gpd-Gl启动子和gfp基因），共转化至色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞（Coprinus cinereu）菌粉孢子的原生质体中。通过选择培养基筛选色氨酸营养恢复型（trp+）的假定转化子。然后利用PCR技术，Southern杂交技术和绿色荧光分析技术鉴定假定转化子。实验结果显示：在
7、荧光显微镜下，部分Southern杂交阳性转化子能观察到绿色荧光，说明假定灵芝gpd-G1启动子能在灰盖鬼伞中启动绿色荧光蛋白基因的表达，即证明了灵芝gpd-G1启动子在灰盖鬼伞中具有启动外源基因转录的活性，可为建立食用菌外源基因表达系统提供必要的基因表达元件。作品的科学性、先进性及独特之处科学性：本研究的科学性体现在以下3方面：(1)选择灰盖鬼伞为宿主研究显示同源启动子有利于受体细胞调控因子的识别，减少甲基化，促进外源基因整合到染色体上，从而提高转化效率和外源基因的表达效率。灵芝与灰盖鬼伞同为大型真菌，在分类学上都属于担子菌纲，有一定的亲缘性，因此其启动子识别因子相同或相似，灵芝gpd启动子
8、转化进灰盖鬼伞后，能被识别并发挥启动子活性。本试验转化的受体为灰盖鬼伞粉孢子，其为单核体。在细胞的有丝分裂过程中，单核体能够把一套完整的DNA 复制传给子代细胞，能增加继代的稳定性。此外，灰盖鬼伞是大型真菌研究的模式材料之一，其基因组序列已经公布，研究背景清楚，且生长速度快，易于在实验室培养。因此选择灰盖鬼伞为宿主菌具有科学性和可靠性。(2)gpd启动子真核生物基因由增强子、位于基因上游的启动子、结构基因（由许多非编码序列，内含子间隔开）、终止子组成。这些元件控制了基因的表达和调控。其中，启动子是指能被RNA聚合酶识别，与之结合并开始转录的一段DNA序列，是基因转录的关键性顺式元件。gpd启动
9、子是食用菌遗传转化中研究和应用最多的启动子之一，gpd基因编码3-磷酸甘油醛脱氢酶，为糖酵解途径中的一个关键酶。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，GPD蛋白的含量达到细胞中可溶性蛋白总量的5%，从而推断gpd的启动子为强启动子。Hirano T 等（1999）用香菇gpd启动子构建了载体pLG-hpt 转化香菇，得到了高效表达潮霉素抗性基因的转化子。此后，由香菇 gpd 启动子构建的外源表达载体在平菇、灵芝里也得到了高效稳定的表达。在国外的报道中，gpd启动子也从双孢蘑菇、裂褶菌、金针菇、云芝等其他食用菌中分离得到，并在各自同源转化中都表现出很强的功能活性。因此
10、我们推断灵芝gpd启动子是高效的启动子，其功能活性值得探究。(3)绿色荧光蛋白报告基因绿色荧光蛋白来源于维多利亚生物发光水母，具有荧光性质稳定、直观、操作方便，不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测且检测灵敏度高，安全无害等的优点。以gfp基因作为启动子活性检测的报告基因，只要检测荧光的存在，就可以证明启动子的启动活性，操作方便，结果可靠。先进性及独特之处：(1)灵芝gpd启动子功能活性鉴定的重要性目前，虽然食用菌生产已成为我国农业中种植业、养殖业、菌物业三大产业之一，但是对食用菌生物技术研究相对很少，大多只是集中在常规的菌种选育，引种驯化，引进开发，技术推广上。本研究立足于食用菌基础研究，
11、研究结果将有益于我国食用菌生物技术的发展。食用菌基因工程的研究滞后的主要原因是缺乏有效的启动子和稳定的遗传转化体系，从而导致了食用菌转化效率低，外源基因表达水平低。目前基因工程技术在食用菌中的应用主要集中在生物反应器研究，即通过转入特定基因，表达有价值的外源蛋白，使其具有各种抗性能力或提高生理代谢能力。这些方面的应用都涉及外源基因的表达问题，要使外源基因在食用菌内得到高水平的表达，高效的启动子是必不可少的。本作品证明了灵芝gpd启动子确实具有很强的启动活性，可以应用于食用菌外源基因表达系统的构建，从而解决食用菌基因工程中的瓶颈难题。迄今，未见有对灵芝gpd启动子在灰盖鬼伞中功能活性的研究报道，
12、因此本研究具有先导意义。(2)启动子序列分析及转化分析的比较目前启动子功能预测主要是以转录因子特异结合的启动子元件序列特征为依据。对于典型的基因结构和启动子特征，某些软件一般能预测出来，但是就目前的数据库而言，仍然有相当一部分预测不出来或预测出错，尤其采用人类基因组信息来预测植物、真菌等远缘物种的基因结构时更是如此，原因在于目前植物、真菌等自身的生物信息学数据库远没有人类的全面和完善。而且这些特征结构并不为启动子所独有，它们散布在整个基因组中。目前，只是在序列的生物学功能如mRNA的转录起始和转录机制都清楚的情况下，基于此方法才能获得满意的识别率（熊清，2004）。而转化分析仍然是启动子分析最
13、为主要和准确的途径。在启动子的稳定转化分析过程中，其最大的难点是外源基因的转化和报告基因的检测。不同的受体细胞，其转化的方法和报告基因的选择与检测都有不同的选择。而本实验合理选择大型真菌灰盖鬼伞为受体，利用绿色荧光蛋白基因( gfp基因 ) 为报告基因，采用PEG介导的转化方法，把灵芝gpdG1启动子与绿色荧光蛋白基因构建的表达载体导入受体中，成功鉴定灵芝gpdG1启动子的功能活性。作品的实际应用价值和现实意义用于建立食用菌外源基因表达系统，即食用菌生物反应器，由于食用菌具有很强的外泌蛋白能，非常适合生产各种有价值的外源基因编码的蛋白产品，由于食用菌的食用安全性，其产品将更为安全，更易被消费者
14、接受。例如：Cyanovirin-N是新发现的一种能够有效抑制HIV感染的天然蛋白，Zhang C等（2004）利用双孢蘑菇成功的表达了Cyanovirin-N，从而使得能大量获得这种蛋白用于医学治疗。用于构建食用菌遗传转化载体，应用于食用菌的基因工程育种，大大缩短传统菌种选育的周期，同时为提高食用菌品质和培育新菌种开辟新的途径，有益于我国食用菌产业的发展。例如：草菇不耐低温，不能低温保藏，从而限制了草菇的销售和生产。郭丽琼等（2003）将来源于昆虫的高活性抗冷冻蛋白基因（THP）转化草菇，获得耐寒冻的转基因草菇，初步解决了草菇不能低温保藏的问题。又例如：将编码纤维素或木质素降解酶基因导人食用菌体内，以提高食用菌菌丝体对栽培基质的利用率或开拓新的栽培基质，最终提高食用菌产量。这些都是是常规育种很难实现的。用于解决当前食用菌遗传转化研究中整合表达率不高，转化子不稳定等问题。Peng M 等(1992)使用由构巢曲霉 gpd 启动子驱动hph基因的质粒pAN71在转化平菇时，虽然得到了转化子，但是一些转化子在没有潮霉素选择压力的条件下培养3到6周后，出现了抗性丢失的现象,究其原因是hph基因并没有整合到染色体上。Irie T 等（2001）同
