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1、StudiesonvibrioparahaemolyticusbyPCRduringthefourseasonsinthesouthcoastoftaiwan 指導老師 張福林副教授研究生 陳念群 1 Introduction 2 致病三大弧菌 V vulnificusV choleraeV parahaemolyticus霍亂弧菌與腸炎弧菌是食品界及防疫單位最重視的食品中毒菌 資料來源 行政院衛生署 3 4 TCBSV parahaemolyticus 直徑1 2mm 有光澤 綠色V cholerae 直徑2 4mm 平滑 黃色 中心不透明 周圍透明嗜鹽性試驗 0 1 6 8 10 V pa
2、rahaemolyticus 6 8 生長良好V cholerae 0 1 生長良好 5 Vibrioparahaemolyticusisoneofthemostimportantfood bornepathogensinTaiwan Japanandothercoastalcountries Vibrioparahaemolyticusisagram negative halophilicbacteriumthatoccursnaturallyinestuarineenvironmentsworld wide EnvironmentalMicrobiology5 8 706 710 2003
3、 6 Thermostabledirecthemolysin TDH TDH TDH relatedhaemolysin TRH UreasepositiveLethaltoxin附著因子 致病因子 7 PathogenicV parahaemolyticusgenerallyproducesathermostabledirecthemolysin TDH Morethan90 ofclinicalV parahaemolyticusisolates butfewerthan1 offoodorenvironmentalstrainsproduceTDH APPLIEDANDENVIRONME
4、NTALMICROBIOLOGY Mar 2003 8 橫跨四季有系統地蒐集 保存與研究台灣南部海域中的腸炎弧菌 並且進行一些基本特性分析 進而由分析結果來評估腸炎弧菌在台灣南部海域的分佈情形 而最後再來加以更深入的探討 Aim 9 研究架構 海水 有機樣本收集 水質測量 傳統方法培養腸炎弧菌 利用腸炎弧菌ToxR基因專一性引子進行最確數 聚合酵素連鎖反應 MPN PCR 偵測樣本中全部的腸炎弧菌密度 利用PCR偵測樣本中致病性腸炎弧菌 tdh trh 及分析KP和血清型 數據整理與分析 10 採樣地點 安平漁港興達漁港前鎮漁港 11 採樣方法 水樣 利用採樣筒丟入海水中採得水樣後放入無菌塑膠
5、試管中有機物質 刮取岸邊岩石上的藻類 貝類或水中魚類後放入無菌塑膠試管中保存於室溫3小時內帶回實驗室分析 12 水質測量 PH METTLERTOLEDO 比重鹽度溫度 VWR1551 004 透視度濁度 HACH46500 00 綜合水質DO TDS EC DR 2500ProtHACH5900 COD HACHCODReactor HACHODYSSEY 13 Samplecollection 3水樣3有機樣本 APW每管APW各取1loop接種於TCBS抽取DNA挑選典型綠色菌落分別各接種於TSB 2及TSA 2PCR toxR 由TSB 2抽取DNAPCR toxR toxR toxR
6、 PCR tdh PCR 16SrRNA toxR PCR trh 致病性分析生化鑑定菌體抗原PCR tdh KP試驗PCR trh 14 toxR 對腸炎弧菌的專一性非常強L GTCTTCTGACGCAATCGTTGR ATACGAGTGGTTGCTGTCATG JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY Apr 1999 p 1173 1177 15 TDH TRH 通常致病性腸炎弧菌都會具有的致病因子TDH L GGTACTAAATGGCTGACATCR CCACTACCACTCTCATATGCTRH L GGCTCAAAATGGTTAAGCGR CATTTCCGCTCT
7、CATATGC AppliedandEnvironmentalMicrobiology Nov 2004 P 6401 6406 16 16SrRNA 所有的菌都具有16srRNA 於是選擇保守的序列來做為primer 這樣就可知道樣本中的DNA是否有毀損 L ACGGCGCAGACTCCTACGGGAGGCR GGGTTGCGCTCGTTGCGGCACTTA JournalofClinicalMicrobiology Aug 1994 P 1911 1917 17 生化鑑定 18 KP 使用Wagatsumaagar加以培養 若有 溶血 在培養基上形成透明圈 現象則稱為Kanagawaphe
8、nomenon KP陽性 很可能就是致病菌株 19 一 方式 西元年 月 地點 樣本編號 菌株編號 二 說明 西元年2005 取後二碼05月份 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12地點 安平港 A興達港 B前鎮港 C樣本編號 菌株編號 自01開始編號例如 0508A1302 命名系統 20 RESULTS 21 Table1 安平港水質結果 22 Table2 興達港水質結果 23 Table3 前鎮港水質結果 24 Fig1 AmplificationofthetoxRgenebyPCR 123456 368bp Theprimersamplifieda36
9、8bpfragmentLane1 100bpmarkerLane2 CCRC10806Lane3 negativecontrolLane4 sampleLane5 sampleLane6 100bpmarker 25 原液 10倍 100倍 1000倍 90ml緩衝液 90ml緩衝液 90ml緩衝液 10ml原液 每稀釋檢液各接種3支 稱三階三支 並於35 37 培養16 18小時 26 Table4 判定為腸炎弧菌陽性者 利用最確數表 如附表 推算出腸炎弧菌之最確數 MPN g或MPN ml 27 DataTemp pHMPN MPN ml或g MPN PCR toxR MPN ml或g 0
10、508Awater1327 6211000508Aorganics2308 3835 11000508Aorganics3327 58290 11000508Bwater1286 893 6930508Bwater2287 4111000508Borganics2287 413 0 11000508Borganics3297 0828 11000508Cwater1298 2711000508Corganics3298 27 3 664 Table5 Vibrioparabaemolyficusdensitiesindifferentsamplesfromthreeareas 28 DataT
11、emp pHMPN MPN ml或g MPN PCR toxR MPN ml或g 0509Awater1297 93159 20509Awater2297 937 49 20509Awater3297 943 6230509Aorganics1297 937 2 11000509Aorganics2297 9311000509Aorganics3297 9411000509Bwater1307 843 03 00509Bwater2307 913 6430509Bwater3307 8915 11000509Borganics1307 843 011000509Borganics2307 91
12、152900509Borganics3307 896 1 11000509Cwater1298 11 3 63 60509Cwater2298 14 3 6 3 60509Cwater3298 16 3 6 3 60509Corganics1298 11 3 63 60509Corganics2298 143 6230509Corganics3298 16 3 623 Table6 Vibrioparabaemolyficusdensitiesindifferentsamplesfromthreeareas 29 DataTemp pHMPN MPN ml或g MPN PCR toxR MPN
13、 ml或g 0510Awater130 17 123930510Awater230 17 763 11000510Awater330 17 859 2360510Aorganics130 17 127 4 11000510Aorganics230 17 7611000510Bwater131 18 029 2930510Bwater230 87 836 1 11000510Bwater330 87 949 2430510Borganics131 18 023 0 11000510Borganics230 87 8315930510Borganics330 87 946 2 11000510Cw
14、ater130 28 18 3 6 3 60510Cwater230 28 233 0750510Cwater330 28 17 3 63 60510Corganics130 28 17 3 6 3 60510Corganics230 28 23 3 6230510Corganics330 28 17 3 623 Table7 Vibrioparabaemolyficusdensitiesindifferentsamplesfromthreeareas 30 V parahaemolyticusdetectedbySample n CulturemethodtoxR PCRWater n 27
15、 14 51 9 20 74 1 Organics n 27 18 66 7 26 96 3 Total n 54 32 59 3 46 85 2 Table8 DetectionofVibrioparahaemolyticusfromwaterandorganicsamples 31 123456789101112 Fig2 Amplificationofthe16SrRNAgenebyPCR Theprimersamplifieda763bpfragmentLane1 markerLane2 0508C32Lane3 0508C33Lane4 0508C34Lane5 0508C35Lan
16、e6 0508C36Lane7 0508C45Lane8 0508C47Lane9 0508C48Lane10 negativecontrolLane11 nosampleLane12 nosample 763bp 32 Fig3 tdhFig4 trh Theprimersamplifieda251bpfragmentLane1 markerLane2 0508A41Lane3 0508A42Lane4 0508A43Lane5 0508A44Lane6 0508A45Lane7 0508A46Lane8 0508A47Lane9 0508A48Lane10 0508A49Lane11 vp1Lane12 negativecontrol 123456789101112 123456789101112 Theprimersamplifieda250bpfragmentLane1 markerLane2 0508A41Lane3 0508A42Lane4 0508A43Lane5 0508A44Lane6 0508A45Lane7 0508A46Lane8 0508A47Lane9 05
