《实验十一-Southern杂交分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验十一-Southern杂交分析（45页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、11 植物基因组DNA的Southern杂交 1 植物基因组DNA的提取与纯化2 植物基因组DNA的酶切3 酶切基因组DNA的凝胶电泳和Southernblotting4 探针序列的获得与标记5 探针与基因组DNA的杂交6 杂交信号的检测 主要步骤 一 Southernblotting 变性DNA转移到膜上 盐转 20 SSC为转移液 转移后DNA不能与尼龙膜共价结合 需要紫外交联 碱转 0 4MNaOH为转移液 转移后的DNA可直接与带正电荷的尼龙膜共价结合 带正电荷的尼龙膜 分子量大于8kb的DNA分子 从凝胶转移到膜上的效率很低 所以需要把大片段DNA打断成较小的片段 以方便转移 紫外线
2、照射打断大分子量DNA利用脱嘌呤方法打断DNA分子 注 所有操作均需带手套进行 脱嘌呤方法的溶液配方及实验步骤 脱嘌呤液 中和液 变性液 0 25MHCl 0 5MNaOH1 5MNaCl 0 5MTris HCl1 5MNaClPH7 5 标准柠檬酸盐缓冲液 pH7 0 0 3M柠檬酸三钠3MNaCl 酶切基因组DNA的凝胶电泳 1 配制0 8 或者1 0 的琼脂糖凝胶 注意胶的厚度和胶孔大小是否合适 在能满足需要的情况下 胶浓度越低 胶越薄越好 2 点样 基因组DNA酶切电泳一般用 HindIII作为DNA分子量标记 建议干点 即先加入与凝胶持平的新的电泳缓冲液 使胶孔里没有液体是点样 之
3、后电泳至样品迁移出胶孔后添加电泳缓冲液至高于凝胶液面1 2mm 3 电泳 先用高电压使样品迁移出胶孔 再改用低电压 1 1 5V cm 低电压过夜 至溴酚蓝到达凝胶下部1 5 2cm时停止电泳 4 凝胶照相 注意紫外照射时间越短越好 然后对凝胶进行修整 切去胶孔和边缘不含DNA的部分 注意保持边缘齐整 在凝胶正面的右上角切掉一小块以示方向 之后用记录凝胶的长和宽 凝胶处理过程中准备一块与凝胶相同大小的尼龙膜和两张滤纸 在尼龙膜的右上角剪掉一小块以示方向 如有需要 用铅笔在右下角写好编号 琼脂糖凝胶的处理 1 若使用碱转法 可以直接将凝胶中大于8kb的部分置于紫外灯下照射10 15分钟后用于转膜
4、 2 若使用盐转法 则按照脱嘌呤步骤进行凝胶的处理 盐转法脱嘌呤步骤 1 用0 25M的HCl室温漂洗凝胶至溴酚蓝的蓝色变成黄色 约15min 50rpm 2 用灭菌的双蒸水洗掉凝胶表面的HCL溶液 漂洗5min 3 用变性液室温漂洗凝胶两次 每次15min 50rpm 使DNA变性 之后用蒸馏水漂洗凝胶 4 用中和液室温漂洗凝胶两次 每次15min 50rpm 之后用蒸馏水漂洗 5 在20 SSC中平衡凝胶10min 等待转膜 6 剪好的膜先用灭菌的蒸馏水润湿 膜漂浮在液面上 然后在2 SSC中平衡 膜可以没入溶液中 滤纸用2 SSC润湿 毛细管转移 Southern转膜过程 1 找一块比凝
5、胶大的平台 如大型的制胶板 放入适当的托盘中 加入20 SSC转移液 2 平台上铺一层比凝胶稍大的用20 SSC浸透的厚滤纸或2 3层普通滤纸 滤纸两头接触到托盘中的20 SSC溶液 滤纸和平台之间不能有气泡 3 将凝胶正向放于平台上湿润的滤纸中央 滤纸和凝胶之间不能滞留气泡 4 用保鲜膜围绕凝胶周边 但不要覆盖凝胶 以此作为屏障 防止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中 液流 短路 现象是导致凝胶中的DNA的转移效率下降的主要原因 5 切一叠 5 8cm高 与滤纸同等大小的纸巾 将其放置在滤纸的上方 并在上方放一块玻璃板 玻璃板上压重物 使DNA转移持续过夜 可转移5 8小时 6 转移结束后
6、 揭去凝胶上方的纸巾和滤纸 将湿润的尼龙膜直接进行紫外交联固定DNA到尼龙膜上 对转移后的凝胶 可在紫外透射仪上观察是否还有残留的DNA 转移方法和膜注意事项 1 凝胶电泳的标准操作方法 胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章 胶中不加入EB会更好 因为EB可能引起背景不均匀的问题 EB也可以加入到样品中 2 所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验 3 根据我们的经验 用20 SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果 4 碱性转移 如在0 4MNaOH中 不适用于地高辛标记分子量marker的转移 DNA的转移和固定 固定
7、操作 将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作 膜的储存 请根据下表选择膜的储存方法 二 探针标记和检测 此试剂盒采用DIG 地高辛 一种甾类半抗原 steroidhapten 去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测 附加仪器与所需试剂 DIG HighPrimelabeledprobescanbeusedinnorthern Southern anddot blotanalysis aswellascolonyandplaquehybridizations Thiskitoffersrandom primedlabelingofDNAtemplateswithDIG 11 dUTP a
8、lkali labile andchemiluminescentdetectionoftheDIG labeledhybrids Thiskitwasassembledwithconvenienceinmind offeringready to useCSPDsuppliedwithadrippingdeviceforeasyapplication ready madeblockingsolution andDIGEasyHybgranules TheDIG HighPrimemixtureincludesstabilizedKlenowenzyme nucleotides primers a
9、ndreactionbuffer allinoneconvenientreagent Application Sensitivityandspecificity Standardassayuses1 goflinearizedpBR328 Itisusualtoexpect0 8 glabeledDNAafter1hoflabeling and2 3 glabeledDNAafter20hreaction Inadotblothybridization 0 03pgofhomologousDNAisdetectablewithchemiluminescence probeconcentrati
10、onsat20ng ml Asinglecopyhumangene t PA isdetectableinaSouthernblot loading1 gofdigestedplacentaDNA ProductDescription DIG HighPrime 5xconc 50 l 用于探针标记 DIG labeledControlDNA 20 l 5 g ml pBR328 linearizedwithBamHI 用于估测探针产量 DNADilutionBuffer 3x1ml 用于估测探针产量 Anti digoxigenin APConjugate 50 l 化学发光检测探针 靶序列
11、杂交 CSPD ready to use 50ml 化学发光检测探针 靶序列杂交 BlockingSolution 10 xconc 4x100ml 化学发光检测探针 靶序列杂交 DIGEasyHybGranules 4x100ml 用于探针与膜的杂交 KitContents 用20 SSC采用毛细管转印的方法使DNA转印到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果 1 探针标记与标记效率的检测 杂交工作溶液的制备分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶 7号瓶 中 然后立即在37 条件下搅拌5分钟进行溶解 杂交温度适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的 具
12、体的公式如下 Tm 49 82 0 41 G C 600 I I 能够杂交上的片段的长度 以碱基对进行计算 Topt Tm 20 25 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50 甲酰胺的标准方程式计算得到的 用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt 要比计算出的Tm低20 25 Topt 可以作为一个严谨的杂交温度 允许探针和靶序列之间有18 的错配 当你的探针与靶序列的相似度低于80 时 你应该相应的降低Topt 大约每1 的错配要降低1 4 同时相应的调整严谨洗涤步骤 即提高SSC浓度和降低洗涤温度 2 预杂交和杂交 杂交液的储存 含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在 15
13、到 25 可以反复使用几次 在每次使用前需要68 新鲜变性10分钟 注意 不可以将杂交液煮沸 3 洗膜 需要附加的试剂 4 免疫检测 试剂盒工作溶液的制备 免疫检测步骤 完成一张100cm2膜的免疫检测方法 注意 所有的孵育均是在15 25 下 振荡完成的 如果膜还需要再次与探针杂交 那么任何时候都不要让膜干 1 显影液 D 76显影液2 停影液 2 冰醋酸溶液 980ml水 20ml冰醋酸 3 定影液 F 7定影液 底片曝光所需试剂 免疫检测步骤 思考题 1 什么是探针 写出常用的四种探针标记方法并简述其标记原理 2 Southern杂交中 DNA转移有哪些常用方法 3 Southern杂交中 为什么要进行封闭 预杂交
