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1、应用海洋生物红细菌目HTCC2654中提取的一种新型环氧化物水解酶提高缩水甘油苯基醚生物催化分辨率Jung-Hee Woo,1,3 Ji-Hyun Kang,1 Young-Ok Hwang,1 Jang-Cheon Cho,2Sang-Jin Kim,1 and Sung Gyun Kang1,摘要：海洋微生物不懈努力产生一个高度发展专一性的不对称环氧化水解酶，人们发现，红细菌目HTCC2654对消旋缩水甘油苯基醚（GPE）高度不对称。运用开放阅读框（ORF）从细菌基因组HTCC2654提取一个假定的环氧化物水解酶（EHase）基因，并克隆在大肠杆菌中表达和纯化。纯化的环氧化物水解（S）-
2、GPE的活性超过（R）的GPE的优先。依据光学纯（R）的理论，从29.2毫米GPE的动力学拆分外消旋用纯化的则热可能与对映体纯度超过99.9，对映体过量（EE）和38.4的收益率在20分钟（对映体比值（理论，50）获得（E值）：38.4）。在对GPE的对映体选择性活动的分析也证实了邻二醇，三苯氧基- 1,2 -丙二醇。据我们所知，这项研究表明，运用已知的原生纯化生物催化剂最高对映体的选择性GPE的分辨率。 2009年，生物技术学会，日本。保留所有权利。关键词：缩水甘油苯基醚;不对称，环氧化物水解酶，海洋微生物;动力学拆分光学纯的环氧化物和邻二醇是为对映体纯生物活性化合物的制备（1，2）多功能合
3、成中间体。芳环氧化物和缩水苯基醚（GPE的）是一种手性氨基醇（3）如-阻断剂（4）生物活性化合物的合成可能有用的中间体。对环境温和的条件下制备手性合成子等最有希望的途径之一是对映体选择性水解外消旋环氧化合物使用辅助因子独立环氧化物水解酶（环氧化物水解酶;欧共体3.3.2.3）（5，6）。环氧化物水解酶是，已经从广泛的来源等多种细菌，酵母菌，真菌，昆虫，植物和哺乳动物（6,7）分离无处不在的酶。由于光学纯的环氧化物的对映体选择性环氧化物水解酶通过动力学拆分生产潜力的应用，已开发数环氧化物水解酶（8-10）。然而，数量有限的EHase对映体选择性需求研究，探讨了新对映体选择性环氧化物水解酶环氧化合
4、物对映体在制药行业的生产。海洋覆盖了地球表面的四分之三，因此提供丰富的生物技术研究和开发资源。海洋生物合成代表着陆地生物，因此代表了广大的合成，如医药，水产养殖和渔业，工业，研究工具和环境应用许多不同领域的潜在利益未开发的资源一个完全不同的环境。海洋生物，尤其是代表伟大的系统发育多样性，使它们具有独特的遗传信息和可能发展的重要自然资源（11，12）库。此外，海洋微生物基因组测序的摩尔基金会可以方便快速的克隆，起源于海洋环境对各种基因组数据库的筛选最近的报告中/水解酶折叠系列（13）环氧化物水解酶一个假定的或可能环氧化物水解酶表征和表达。开发各种海洋环境对映体选择性生物催化剂，我们一直在活性筛选
5、，常规分子工程和基因组方法（14-16）的组合各种海洋环境环氧化物水解酶活动。在本研究中，我们描述了不对称环氧化物水解酶的一个高度，从红细菌目HTCC2654。假定环氧化物水解酶基因红细菌目HTCC2654从河（则热）进行了克隆和在大肠杆菌中表达。重组蛋白（则热）是由金属亲和层析柱纯化，以及对理论依据（图1）则热动力学参数进行了进一步纯化的特点。材料与方法：材料：购自于Aldrich公司消旋的GPE。从Acros Organics公司（莫里斯平原，新泽西州，美国）购买的是消旋3苯氧基- 1,2 -丙二醇（PPD）。所有材料分析或试剂级。该chiraldex-环糊精三氟（国集团助教，0.25 m
6、m内径，30米长）的气相色谱（GC）的列均购自Supelco（贝尔丰特，宾夕法尼亚州，美国）。在Chiralcel外径- H的（4.6 mm内径150毫米的长度）高效液相色谱法（HPLC）柱购自Diacel工业化学（东京，日本）。其他仪器购自默克和Difco公司。HTCC2654 菌株和细菌的生长条件是培养在海洋肉汤（Difco公司）25，2天。对于存储，细菌细胞悬浮于 海洋肉汤并储存在10（体积/ V）的甘油，-80备用。分别使用IL的细胞（Stratagene公司，拉哈拉，CA，美国）中的DH5和BL21 - CodonPlus大肠杆菌（DE3）中，R作为传播和基因表达质粒。 菌株进行培养
7、卢里亚- Bertani（磅）在37中等，加入适当的抗生素。DNA的控制和DNA测序DNA操作均使用（17）的标准程序。限制性内切酶和其他修饰酶购自Promega公司（麦迪逊，威斯康星州，美国）。小规模的大肠杆菌细胞质粒DNA的制备是用一个质粒小型试剂盒（Qiagen公司，希尔登，德国）。DNA序列进行了自动测序仪（ABI3100）使用BigDye终止试剂盒（体育应用生物系统公司，福斯特市，加利福尼亚，美国）。BLAST搜索和多序列比对要克隆一个从红细菌目HTCC2654，序列搜索（钐- X的怒族的X -钐钐主题和HGXP）环氧化物水解酶对R的细菌的基因组序列HTCC2654测定摩尔基金会进行
8、了利用Ensoltek ProteinFinder方案和基本局部比对搜索工具（BLAST）的程序码。候选环氧化物水解酶成对比较，并报告环氧化物水解酶进行了与CLUSTAL W程序（18）。由此产生的候选人手动确认为假定的环氧化物水解酶残留物的存在。序列含有开环酪氨酸，HGXP主题和Sm- X的怒族的X -钐钐（钐=小渣中，x=任何残留和Nu=亲核）主题被选定并与已知环氧化物水解酶一致起来序列。系统发育分析，环氧化物水解酶序列是取自SwissProt或EMBL蛋白数据库和分析。系统发育的距离，计算了使用CLUSTAL W程序，和系统进化树是由3.1分子进化遗传分析软件（生物设计研究所，天普，排列
9、，美国）（19）绘制。使用试剂盒（Promega公司）按照制造商的指示从红目细菌HTCC2654基因组提取DNA，从则热细菌基因克隆分离基因组。全经NdeI和XhoI位点两侧则热基因扩增长度与正向引物聚合酶链反应（rehF：5- CGACCCGGCATATGAACGACAAGACCTTTATCGAGACGAAC GGC- 3）和反向引物（rehRH：5CTCCACATCTCGAGTTACAAGGCTGAAAAGAACACTCGCAAATC- 3）。下划线的序列表明NdeI网站在正向引物和反向引物XhoI位的网站。对于则热没有他的标签，反向引物表达（rehRNH：5- CTCCACATCTCGA
10、GTCAAAG CGTGGCGAGCCAGTCGATGA-3），也被设计。被放大的DNA片段与NdeI和XhoI的消化，片段结扎NdeI/ XhoI位消化的质粒pET -24A条（+），然后将重组质粒用于转化大肠杆菌DH5。重组质粒转化BL21介绍- CodonPlus（DE3）中，反相（Novagen）序列后确认的表达。从河则热纯化的细菌HTCC2654阿耕地转化为37，诱导表达于37由1毫米的异丙基- D - 1级-硫代半乳糖苷此外（IPTG）诱导时，在600 nm光密度达到0.4-0.6。经过3小时的诱导，离心收集细胞，在500020分钟，在缓冲液（50 mM的磷酸盐（pH值7.0），0
11、.5米氯化钾和10甘油）悬浮和超声破坏。去除细胞碎片离心1500030分钟，用它绑定纯化试剂盒。可溶部分是应用于镍氨三（镍NTA）的柱结合缓冲液（氯化钠500毫米，20毫米磷酸盐（pH值7.0）和5毫米咪唑）平衡。在与洗涤缓冲液（氯化钠500毫米，20毫米磷酸盐（pH值7.0）和60毫米咪唑）洗涤，结合酶与洗脱洗脱缓冲液（氯化钠500毫米，20毫米磷酸盐（pH值7.0）和1米咪唑）和然后对50毫米透析磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。蛋白质的纯度是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）对下检查所变性（20）中Laemmli所述的条件。蛋白浓度测定由Bradford法（21）使用
12、作为一个对映体选择性标准环氧化物水解酶。环氧化物水解酶检测牛血清白蛋白的活性生物Rad蛋白检测试剂盒测定按胡埃塔尔（15）略作修改。纯化环氧化物水解酶（100微升）的混合消旋GPE的（29.2毫米），10毫升含1 100毫米的Tris - HCl（pH值8.0），然后在25毫升小瓶 C的培养孵化时，对样品进行了定期与绘制，并与收获的混合物正己烷（2毫升）中提取。由此产生的提取，分析了21手性地塞米松的G -助教使用气相色谱系统与FID检测器（瓦里安公司，荷兰）配列。对应的峰面积（R）的理论依据或（S）- GPE的是归由作为内标物峰面积均三甲苯，然后转换成与标准曲线比较的GPE的残留量。在气相色
13、谱分析烤箱的温度，进样器和检测器的外消旋GPE的（S）-，GPE的名词= 39分钟;（R）的理论依据，文= 40分钟）分别为90，180和180。氦气作为载体。3苯氧- 1 ,2 -丙二醇邻二醇的绝对构型作为理论依据。 还利用高效液相色谱法手性分析如下。纯化环氧化物水解酶（100微升）在29.2毫米，10毫升含100mMTris -盐酸（pH值8.0）1毫升，混合消旋GPE，然后在25 C的浓度培养。孵化时，样品被撤销定期和收获混合物与正己烷（2毫升）中提取。由此产生的提取物进行分析了一chiraldex的G -助教列使用气相色谱系统与FID检测器（瓦里安公司，荷兰）装备。对应的峰面积（R）的
14、政策依据或（S）- GPE的是归由作为内标物峰面积均三甲苯，然后转换成与标准曲线比较的GPE的残留量。 谱分析中的外消旋GPE的温度（S）-，文=39分钟GPE的;（R）的政策依据，文= 40分钟）的烤箱，喷油器和检测器分别为90，180和180，分别为。氦气为载体gas.The的政策依据，3苯氧- 1,2 -丙二醇，邻二醇的绝对构型也被手性高效液相色谱分析法分析如下。纯化EHase（100微升）的混合消旋GPE的在29.2毫米，10毫升含1毫升的小瓶100mMTris-盐酸（pH值8.0），然后在25 C的浓度孵育对样品进行了定时抽出孵化，然后在反应混合物（500L）被用乙醚（500微升）中
15、提取。那么产生的提取物进行了分析与正己烷:2-丙醇为以1毫升/分钟流量用高效液相色谱系统（惠普，埃文代尔，美国宾夕法尼亚州）为流动相=9:1 chiralcel ODH列。相应峰面积至（r） -或（S）-3 -苯氧基- 1,2 -丙二醇（PPD公司（R）的，文= 10.5分钟的PPD（S）- PPD公司，文=21.4分钟）转换在与标准曲线（22）比较集中。动力学参数测定则热动力学参数的测定气相色谱分析中的应用为基质消旋GPE的。纯化环氧化物水解酶（100微升）混合不同浓度的外消旋GPE的在10毫升含1毫升100毫米的Tris - HCl（pH值8.0），培养瓶在25 C间有在200转颤抖。反应
16、混合物定时抽出。残留的环氧化合物进行了分析与气相色谱正己烷后或由此产生的二醇也与高效液相色谱分析用乙醚萃取后提取。对映体过量（ee）是来自剩余的两个对映体环氧ee值(%)=(的S - R）的/（S+右）100和转换程度（c）在终止前完成EHase检测消费环氧=1 -（卫星+专家系统）/（ERso+埃索），其最初环氧的（R）和（S），记为欧洲南方天文台，和（R）和剩余的环氧（S公司制造）为居（23）。根据陈等人描述的方法。（24），对映体比率（E）是源自转化率（C）和基片（欧洲就业战略），其余的对映体=在对映体过剩程度（1 - c）项（1 -欧洲就业战略）/在（1 - c）项（1 +欧洲就业战略）。动力学参数进行了估计非线性回归利用sigma图计划。结果与讨论：从河细菌HTCC2654环氧化水解酶基因鉴定，我们报道，从海洋微生物环氧化水解酶保留不对称活动（14-16），这表明一例如，海洋微生物可开发价值的生物催化剂可能丰富的油
