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1、 动物血中超氧化物歧化酶 SOD 的提取 分离纯化及含量 活性 相对分子质量的测定 生物技术综合实验 二 P40 70 授课老师 马超韦明肯授课对象 生物技术12 1班 生物技术12 2班 理论内容部分 一 超氧化物歧化酶 简称 SOD 是一种源于生命体的活性物质 能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质 对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果 它们以铜和锌 或锰 铁 或镍作为辅因子 超氧化物歧化酶的来源 超氧化物歧化酶的来源有很多途径 可以根据当地的原料来源 成本需求 技术要求来选取不同的提取途径 其中根据不同的分类有以下几个途径获取该酶 1 植物提取2 动物提取3 微生物的生产发酵4
2、 人工合成 发展历史 超氧化物歧化酶 SuperoxideDismutase EC1 15 1 1 SOD 是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起 人们对SOD的研究己有七十多年的历史 1969年McCord等重新发现这种蛋白 并且发现了它们的生物活性 弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质 所以正式将其命名为超氧化物歧化酶 二 SOD用途及前景 1 抗氧化2 抗衰老3 预防慢性病及其并发症4 抗疲劳5 化疗副作用的消除剂6 避免手术的二次伤害手术会引起大量自由基 故建议手术前后口服抗氧化剂来迅速恢复体力加速伤口复原 超氧化物歧化酶的应用 健康上的应用SOD是
3、人体内最主要的抗氧化物质 是氧自由基的克星和专一清除剂 它清除人体内一些自由基 它保护细胞对抗毒性 调节H2O2的浓度 对付微生物的侵害 并且增强抗氧化酶的活性 迅速清除过剩的自由基 保持身体健康 体力充沛 面容体态年轻 全球118位科学家发表联合声明 自由基是百病之源 SOD是健康之本 体内的SOD活性越高 寿命就越长 药物类主要集中在炎症病患者 尤其治疗类风湿关节炎 慢性多发性关节炎 心肌梗塞 心血管病 肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者 用于生化制药作为一种生化酶制剂 广泛应用于临床和科研上 具有极强的抗衰老 抗肿瘤 调节人体内分泌系统作用 用于化妆品类可添加在化妆品中 具有抗氧化抗腐蚀的
4、优良性能 有减少皱纹 祛斑的功效以SOD为主要成份的产品风靡世界 引发了化妆品历史上的一场革命 使人类永葆青春美丽梦想成真 用作保健食品 饮料如SOD糖 SOD口服液 SOD干啤等都非常畅销 在饮料 糖果 糕点等食品中加入SOD既可利用其抗腐蚀性延长保质期 又可调节人体内分泌系统 总之 超氧化物歧化酶可以清除体内过量的自由基 提高人体免疫力 延缓衰老 有效降低血脂 胆固醇 血压 抗疲劳 增强肝肾功能 抗辐射 对糖尿病有明显的恢复作用 调节女性生理周期 推迟更年期 应用前景 SOD是一种新型的抗炎症药 尤其对关节炎和类风湿关节炎有明显疗效 根据SOD作用机制和毒性试验 它对治疗因O2引起的各种疾
5、病都有一定的疗效 为此 SOD可作为抗衰老 抗炎症 自身免疫疾病患者广泛应用的医药品 此外 SOD对治疗贝切特氏症 心肌梗塞等血虚性心脏病 胶原病 新生儿呼吸困难综合症 防御放射性伤害等也可望有效 近年来美 日 德 英国等对SOD作为药品开发应用进行了一系列研究和临床试验并得到广泛应用 可以预言 随着人们对SOD更广泛深入的研究 不同类型SOD SOD修饰物及人工有机合成SOD模拟酶将在医疗 保健 食品 农业增产等方面发挥出更大的作用 三 SOD提取方法 实验部分 P40 70 一 基本内容 细胞破碎及酶的抽提 两种蛋白质含量测定方法及酶的活力测定 离子交换柱分离操作及分析 SDS PAGE电
6、泳测定蛋白质分子量 固定化酶的制备技术 6 酶的柱层析分离操作 包括装柱 恒流泵及部分收集器的试调 上样 洗脱等 7 IEF测蛋白质PI 8 POD同工酶分析 9 细胞器的分离及其标志物 酶 的测定 二 目的要求 学习提取分离纯化超氧化物歧化酶的方法 掌握酶分离纯化的基本操作技术 包括以下内容 1 细胞破碎及酶的抽提 2 酶的柱层析分离操作 3 酶的活力测定 三 基本原理 超氧化物歧化酶 superoxidedismutase SOD EC1 15 1 1 是一种歧化超氧负离子自由基O2 生成H2O2和O2的金属蛋白 为胞内酶 在生物体内具有延缓机体衰老 对肿瘤 自身免疫性疾病和辐射损伤具有重
7、要的防御作用 是一种重要的药用酶 根据所含的金属离子 SOD可分为三类 Cu Zn SOD Mn SOD和Fe SOD SOD在生物界中分布极广 原核生物和真核生物中都有存在 本实验从血中提取SOD 提取液经葡聚糖凝胶柱上层析 分离出SOD 然后用邻苯三酚法测定其酶活力 邻苯三酚在自氧化过程中产生有色中间物 红桔酚 和O2 使溶液颜色变褐加深 加入SOD能歧化O2 阻止中间物 红桔酚 的积累 通过分光光度计比色分析反应液的颜色而测定其酶活力 超氧化物歧化酶的工艺流程 动物血液材料中制备超氧化物歧化酶分离纯化工艺分为三个主要步骤 原材料的预处理 乙醇 氯仿除去血红蛋白 粗酶液的制备 有机溶剂沉淀
8、 离子交换柱层析精制 SOD成品 原材料的预处理 材料材料试剂 3 8 柠檬酸三钠 0 9 氯化钠 95 乙醇 氯仿 牛血 器材 恒温水浴 离心机 布氏漏斗 抽虑瓶 烧杯 量筒 搅棒 实验步骤收集 取新鲜牛血 加入到3 8 柠檬酸三钠液中 新鲜猪血与抗凝液的比例为3 1 轻轻搅拌均匀 4000r min 离心20min 收集红细胞 浮选 红细胞用3倍体积生理盐水洗涤 4000r min离心20min 重复3次 溶血 向洗净的红细胞加入1 1 1倍体积去离子水 在5 下搅拌30min 得到溶血物 注意 收集完新鲜血液后 应尽快加抗凝剂去除血红蛋白过程中 搅拌要均匀 去血红蛋白 向溶血液中分别缓慢
9、加入0 25倍体积的预冷95 乙醇和0 15倍体积的预冷氯仿 剧烈搅拌15min左右 静置1h 然后4000r min离心20min 除去变性血红蛋白沉淀 取清夜 过滤 收集滤液 1 热变性原材料的预处理中获得的上清液加热到65 保温10min 然后迅速冷却到室温 3000r min离心20min 弃去沉淀物 收集上清液 2 沉淀清夜在冰浴中冷却 然后在 5 一下的操作温度下 加入1 5倍量预冷丙酮 边加边搅拌均匀 即有白色沉淀产生 静置2 3min 迅速抽滤 弃去滤液得肉色沉淀 沉淀物用少量蒸馏水溶解 4000r min离心20min 除去不溶物 用pH7 6的2 5mmol LK2HPO4
10、 KH2PO4缓冲液透析 即得粗SOD溶液 注意迅速冷却至室温 沉淀过程保持低温哦 三 材料器具 材料 动物新鲜血液 SephadexG 75凝胶 仪器 高速组织捣碎机 高速冷冻离心机 层析柱 1 40cm 自动部分收集器 恒流泵 进样器和微量进样器 可见 紫外分光光度计 试剂 1 pH7 8 5mmol L磷酸缓冲液 内含1mmol LEDTA 2 考马斯亮蓝溶液 称取100mg考马斯亮蓝G 250于50ml95 乙醇中 摇动 待溶解后 加入100ml85 磷酸 反复震动后加蒸馏水定容至1000ml 过滤待用 3 pH8 2 50mmol LTris HCl缓冲液 4 50mmol L邻苯三
11、酚溶液 5 10mmol LHCl溶液 4 试剂的配法 1 pH8 2 50mmol LTris HCl称取Tris0 61g EDTA 2Na0 037g 用双蒸水溶解至80mL左右 用HCl调节pH 8 20 用pH计校正 最后定容至100mL 2 10mmol LHCl 3 50mmol L邻苯三酚称取邻苯三酚0 063g 用10mmol LHCl溶液溶解 定容至10mL 避光保存 4 SOD样液 四 实验操作 一 SOD的提取取新鲜血液 冷水浸泡24h 沥干 加冰冻的pH7 8 5mmol L磷酸缓冲液适量 用高速组织捣碎机捣碎 用高速冷冻离心机以8000rpm离心除去固型物 需4 5
12、次 每次15min 上清液即SOD酶液 二 SOD的凝胶层析分离纯化 1 凝胶的准备 1 称取SephadexG 75干凝胶2g 加适量洗脱液沸水浴溶胀2小时 也可室温溶胀24小时 2 用倾斜法倾去表面悬浮的细小颗粒 室温储存于磷酸缓冲液中备用 2 装柱 1 将层析柱竖直固定于支架上 连接好恒流泵 部分收集器 调节洗脱液的操作压60cm 2 先向层析柱中加入1 3高度的pH7 8 5mmol L磷酸缓冲液 然后用大口进样器吸取上述准备好的凝胶徐徐注入柱中缓冲液内 让其自然沉降 沉降好的柱床顶部离管口1 2cm为宜 若高度不够 可放去部分缓冲液 搅起管中凝胶界面 继续添加凝胶 3 装毕 用2 3
13、个床体积的洗脱液洗脱 以使床柱稳定 3 上样 1 放去床表面上的缓冲液至与凝胶界面平齐 2 用进样器吸取酶液0 5ml 加样时将进样器尖端接触柱内壁并在离床表面数毫米处随加随沿内壁转动一周 使样品尽快分布于全表面 然后打开恒流泵 待样品液面与床柱表面平齐时 关闭恒流泵 以少许 0 1 1ml 缓冲液冲洗内壁数次 在打开恒流泵 放至液面与床柱表面平齐 3 先用进样器加1cm高度的缓冲液覆盖样品 然后加足缓冲液 连接好进液管 4 洗脱 开启部分收集器和恒流泵 以pH7 8 5mmol L磷酸缓冲液进行洗脱 调节流速 控制每管收集洗脱液1ml 每管按收集顺序做好标记 5 洗脱液酶蛋白含量的测定 1
14、取洁净试管数支 分别加入考马斯亮蓝溶液3ml 摇匀 将其中一支试管不加任何试液作为对照管 其余的分别加入从第五收集管起的洗脱收集液50 l 反复摇匀 2 以对照管为调零液 用1cm比色杯在595nm波长下测定各管的OD595nm值 3 合并OD595nm值高的原收集液 此即纯化的SOD酶液 保留测酶活力 4 测定完毕 先用乙醇洗去比色杯的颜色 再用蒸馏水荡洗 用擦镜纸拭干水珠 倒扣在培养皿内 5 清理干净工作台 在仪器使用登记本上登记使用情况 三 SOD酶活力测定 在一般情况下 SOD活性测定只能应用间接活性测定法 其测定方法很多 常见的有化学法 免疫法和等电点聚焦法 其中化学法应用最普遍 化
15、学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 利用SOD分解而间接推算酶活力 在化学方法中 最常用的有黄嘌呤氧化酶法 邻苯三酚法 化学发光法 肾上腺素法 NBT 还原法 光化学扩增法 Cyte还原法等 其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用 本实验采用邻苯三酚自氧化方法 邻苯三酚自氧化法原理 邻苯三酚在碱性条件下 能迅速自氧化 释放出O2 超氧阴离子自由基 生成带色的中间产物 红桔酚 反应开始后反应液先变成黄棕色 几分钟后转绿 几小时后又转变成黄色 这是因为生成的中间物不断氧化的结果 本实验中测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段 中间物的积累在滞留30 45s后 与
16、时间成线性关系 一般线性时间维持在4min的范围内 中间物在325nm波长出有强烈光吸收 当有SOD存在时 由于它能催化O2 与H 结合生成O2和H2O2 从而阻止了中间有色产物的积累 导致吸光值下降因此 通过测定它们在特定波长下得光吸收变化速率计算出SOD的酶活性 邻苯三酚 O2 红桔酚 自氧化 有色物质积累 吸光值增加 O2 O2 2H H202 O2 SOD催化 阻止中间产物积累 吸光值降低 pH 8 2 SOD 实验步骤 1 测定邻苯三酚溶液自氧化速率 取两支试管按右表加入25 预热过的缓冲液 然后加入预热过的邻苯三酚 空白管用10mmol LHCl代替邻苯三酚 迅速摇匀 立即倾入1cm比色杯中 在325nm波长处测定光吸收值 每隔30s读数一次 测定4min内每分钟光吸收值的变化 要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0 070士0 002 可增减邻苯三酚的加入量 以控制光吸收值 2 SOD样液活力测定 样品管取代自氧化管 样品管测定时先加入预热的待测酶液 在25 水浴锅中保温10min 再加入预热的邻苯三酚 其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定 3 数据处理 3 1加入SOD
