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1、饲料粗蛋白的检测方法（凯氏半微量定氮法）1 原理凯氏法测定试样含氮量，即在催化剂存在下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵，加入强碱（NaOH）并蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用标准盐酸溶液滴定测出含氮量，将结果乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白质含量。2 仪器设备2.1 实验室用样品粉碎机或研钵2.2 分样筛：孔径 0.45mm（40 目）2.3 分析天平：感量 0.0001g2.4 消煮炉或电炉2.5 滴定管：酸式 25mL2.6 凯氏烧瓶：100mL2.7 凯氏蒸馏装置：半微量水蒸汽蒸馏式2.8 锥形瓶：150mL2.9 容量瓶：100mL3 试剂3.1 硫酸：分析纯3.2 硫酸铜
2、：分析纯3.3 硫酸鉀：分析纯3.4 硒粉：分析纯3.5 氢氧化钠：分析纯 40g 溶于 100mL 蒸馏水配成 40%水溶液。3.6 硼酸：分析纯 2g 溶于 100mL 蒸馏水配成 2%水溶液。3.7 混合指示剂：甲基红分析纯 0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿分析纯 0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。3.8 0.02N 盐酸标准溶液：1.67mL 盐酸分析纯溶于 1000mL 蒸馏水中。3.8.1 0.02N 盐酸标准溶液的标定（碳酸钠法）精确称取 0.04g 于 270300C 灼烧至恒重的基准级无水碳酸钠，准确至0.0001g，无损失地转入 100 mL 三角瓶中，
3、加入无 CO2蒸馏水(新做蒸馏水或蒸馏水煮沸数分钟放凉后使用)50mL 溶解，并加入混合指示剂 10 滴，用盐酸标准溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸 2 分钟，冷却后继续滴定至溶液呈暗红色，同时做空白试验。3.8.2 盐酸标准溶液当量浓度的计算G N = (V1-V2)0.05299 式中：G无水碳酸钠的重量，g；V1盐酸标准溶液消耗的体积，mL；V2空白试验所消耗盐酸标准溶液的体积，mL；005299每毫克当量碳酸钠的克数；注：标定各浓度间的相对偏差不大于 0.2%。3.9 蔗糖：分析纯3.10 硫酸铵：分析纯，干燥。4 试样的选取与制备选取具有代表性的试样用四分法缩减至 200g，粉碎
4、后全部通过 40 目筛，装于密封容器中，防止试样成分变化。5 测定方法及步骤5.1 试样的消煮称取 0.51g 试样 （粗蛋白含量在 25%以下称取 1g，粗蛋白含量在 25%以上称取 0.5g） ，准确至 0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜 0.4g，无水硫酸钾 6g，硒粉 0.004g，与试样混合，再加浓硫酸 12.5mL，在消煮炉上小心加热，待样品焦化，泡沫消失，加强火力，至溶液澄清后，再加热至少 1h。5.2 氨的蒸馏（半微量水蒸汽蒸馏法）将上述消煮液冷却，无损失地转入 100 mL 容量瓶中，冷却后定容为试样分解液，取 20 mL 2%硼酸溶液，加混合指示剂 2 滴，使半微量
5、蒸馏装置的末端浸入此溶液，准确移取试样分解液 10 mL 注入反应室中，塞好入口玻璃塞，再加入 10mL 40%NaoH 溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室（加碱时流速不可过快，否则会引起硼酸吸收液倒流） ，塞好玻璃塞，并在入口处加水密封好，防止漏气，蒸馏，自吸收液变为蓝色开始计时，4 分钟后，使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏 1 分钟，用蒸馏水洗净冷凝管末端，洗液均流入吸收液。5.3 滴定吸收氨后的吸收液立即用 0.02mol/L 的标准溶液滴定，溶液由蓝色变成灰红色为终点，记录所耗标准溶液的体积。5.4 空白测定称取蔗糖 0.5g 代替试样，重复上述操做，以校正药品不纯所发生的误差，消耗
6、0.02mol/LHCL 应不超过 0.3mL。6 测定结果的计算与分析6.1 计算公式如下：（V-V 0）(N0.0146.25) 100粗蛋白（%）= WV/V 式中：V-滴定试样时所需酸标准溶液体积，mL；V0-滴定空白时所需酸标准溶液体积，mL；N-盐酸标准溶液当量浓度； W-试样重量，g；V-试样分解液总体积，mL； V-试样分解液蒸馏用体积，mL；0.0140-氮的毫克当量数；6.25-氮换算成蛋白质的平均系数。6.2 重复性每个试样取两个平行样，以其算数平均值为结果；粗蛋白含量在 25%以上，允许相对偏差为 1%；粗蛋白含量在 10-25%之间，允许相对偏差为 2%；粗蛋白含量在 10%以下，允许相对偏差为 3%；7 测定步骤的检验精确称取 0.2g 硫酸铵，代替试样，按上述步骤操作，按上述公式计算（不乘系数 6.25） ，测得硫酸铵含氮量为 21.190.2%，否则应检查加碱，蒸馏和滴定各步骤是否正确。8 注意事项8.1 试样消煮时，先低温加热，避免泡沫溢出，待泡沫消失后，再逐渐增加温度，使之微沸，避免剧烈沸腾，否则会使氮分子损失。8.2 加碱必须过量，碱除了与铵盐和剩余的硫酸作用，还与硫酸铜作用生成蓝色氢氧化铜，然后分解为黑色氧化铜。8.3 消化过程中，若硫酸损失过多，可酌量补加硫酸，勿使瓶内干涸。
