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1、第八讲猪链球菌病诊断 猪链球菌病 是由致病性猪源链球菌感染引起的猪疫病的总称 猪链球菌病的临床表现主要是败血症 化脓性淋巴结炎 脑膜炎以及关节炎 OIE列为B类传染病 病原 1猪链球菌2型 Streptococcussuis2 2马链球菌兽疫亚种 Streptococcusequisubspzooepidemicus 旧称兽疫链球菌3D E L S群链球菌 Lancefield 兰氏血清学分群 链球菌分为20个血清群 A B C V I J除外 一 病原分离 1采样活猪 采样用灭菌棉拭子擦拭扁桃体病死猪 扁桃体 肺 肝 血液 有脑炎症状取脑组织 关节炎可取关节囊液 2分离培养 1 培养基 TH
2、B培养基 绵羊血或马血平板 2 培养条件 需氧兼性厌氧 37 pH7 2猪链球菌2性营养要求比马链球菌兽疫亚种低 后者需加3 5 的犊牛血清 二 临床诊断 主要表现为败血症 化脓性淋巴结炎 脑膜炎 心内膜炎 关节炎等 但不同链球菌病原引起的症状类似 故该诊断不能用于确诊 关节炎症状 败血症 1染色镜检猪链球菌2型 革兰氏染色阳性 菌体呈圆形或椭圆形 直径小于2 0 m 一般呈短链或成双排列 革兰氏染色阳性 菌体表面能形成荚膜 二 微生物学诊断 马链球菌兽疫亚种 革兰氏阳性球菌 直径0 5 1um 液体培养基中呈长链 菌体表面能形成荚膜 营养要求较高 在5 犊牛血清生长良好 根据类M蛋白抗原性的
3、差异 该菌至少有15个血清型 马链球菌兽疫亚种猪链球菌2型菌 溶血 图2猪链球菌2型 ZY05719 ATCC35246株 2培养特性猪链球菌2型 菌落形态血平板上呈灰白色小菌落 粘稠 2型在绵羊血平板上呈 溶血 马血平板则呈 溶血 马链球菌兽疫亚种 在血清肉汤培养基中培养该菌 开始时有轻度混浊 继而变清 于管底形成沉淀 于5 绵羊血琼脂 THA 培养基上培养24h 大部分菌株形成3 4mm的粘液样大菌落 产生明显的 溶血 小部分呈非粘液样菌落 大小约1mm左右 3生化鉴定猪链球菌2型 发酵乳糖 海藻糖 水扬苷 部分菌株发酵棉实糖 菊糖 不发酵甘露醇 山梨醇 马链球菌兽疫亚种 能水解精氨酸 发
4、酵乳糖 水扬苷 山梨醇产酸 不能发酵菊糖 甘露醇 棉子糖和海藻糖 V P试验阴性 不产生靛基质 不还原硝酸盐 不液化明胶 三 免疫学诊断 1玻板凝集实验用于猪链球菌2型快速定型 但要求抗体效价高 马链球菌兽疫亚种只能用于定群2乳胶凝集实验敏感性较高 结果容易判断 但有非特异性 3免疫荧光猪链球菌2型 用MRP特异抗体可用于菌体表面其分布的观察 但需用激光共聚焦显微镜 马链球菌兽疫亚种 用类M蛋白特异抗体可用于菌体表面其分布的观察 MRP单抗介导FITC标记SS2表面MRP的激光共聚焦图像 MRP单抗介导FITC标记SS2表面MRP的激光共聚焦图像 SS2多抗介导FITC标记的SS2的激光共聚焦
5、图像 ELISA常用链球菌多克隆抗体包被 以MRP或类M蛋白的单克隆抗体夹心 敏感性高 特异性较强 四 分子诊断 1多酶电泳法 原理 不同型猪链球菌 胞内酶分子的氨基酸有差异 因而电荷有差异 在电场中 其迁移率有差异 用于不同型链球菌的分析 2限制性酶切图谱分析原理 不同种或亚种链球菌基因不同 因而用限制性内切酶酶切后 其电泳图谱不同 用于分离株变异分析 亦可用于不同种或型的鉴定 随机扩增多态DNA分析 RAPD 用多对随机引物进行PCR扩增 可得到不同的产物 且产物具有多态性 可用于种或型的鉴定或分离株变异分析 PCR猪链球菌2型 mrp ef cps2 orf2以及溶血素基因均可作为靶基因
6、进行检测cps2具有型特异性 mrp ef sly CPS212345 1 HA9801 2 ZY05719 3 Marker 4 5 阴性对照 250bp 500bp 750bp M12 2000bp 1000bp Maker1 HA9801 cps2 2 ZY05719 cps2 cps2 250bp 500bp 750bp 2000bp M1234 ef mrp gdh orf2 Maker1 ef 626bp 2 mrp 316bp 3 gdh 688bp 4 orf2 858bp sly fbps Maker1 sly Maker1 fbps 1040bp 100bp 250bp 5
7、00bp 750bp 1000bp 2000bp M123 M DL Marker20001 ZY05719 gapdh 2 HA9801 gapdh 3 空白对照 gapdh 图8orf2PCR检测结果1marker 2 4 7 13PCRproductsofswineStreptococcus 2HA9801 5 6negativecontrol 1DL2000market2 3PCRproductofATCC352464PCRproductofstreptococcussuistype2HA98015PCRproductofStaphylococcusaureus6PCRproductofAvainEscherichiacoliO1 ATCC35246株类M基因PCR结果
