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1、脲型 Cerasome 的类脂的合成及制备研究成果指导教师：王剑锋 主研人：刘利 成员:于康妮、陈娟超分子化学的发展方向之一是构建脂质体的高阶结构，即构成稳定可靠结构的层层堆积的超分子聚集体，这是制备新材料重要基础，从仿生化学角度看单个脂质体作为人工细胞模型，脂质体多聚体则可以作为人工组织的模型。但是传统的脂质体靠疏水作用存在于水中，脂质体自身不够稳定，因此在本研究中制备的有机无机杂化脂质体-Cerasome 具有表面硅氧键构成的类似于陶瓷结构的网络连接，因此大大强化了脂质体的稳定性，而且因为类脂还含有酰胺键类似于肽键结构，因此在脂质体中形成一圈氢键带，也对脂质体的稳定起到了辅助作用。关于脂质
2、的合成，目前已经进行了很多的工作，合成出了大量带有不同官能团，应用在各领域的脂质。由生物源材料合成的脂质既具有合成脂质易于分离提纯、稳定不易氧化的特点、又具备生物源脂质无毒及无免疫源性的特点，由其制成的脂质体可以做作为药物载体或仿生分子器件组成成分的首选。本研究从仿生化学的角度出发，制备了一种种有机-无机杂化脲型脂质Cerasome，同时合成两种含 Schiff 碱结构人工受体，并将其嵌入到 Cerasome脂质膜上，构建了两种人工细胞信号转导的超分子体系。在制备 Cerasome 脂质体的过程中，一般采用乙醇注射法和薄膜振荡超声法，在第一种制备法中，首先要把类脂在酸性乙醇溶液中水解经过溶胶-
3、凝胶过程，然后注入在水溶液中通过自组装形成 Cersome。但是当需要在脂质体中嵌入某种设计的分子时，尤其是疏水性比较强的有机分子的时候，由于有机分子不能溶到酸性乙醇的水解液中，因此不能通过这种注射的方法进行制备。第二种方法中，薄膜震荡超声法是首先将脂质体溶解在氯仿中，然后吹干制成薄膜并真空干燥，加入水溶液后，震荡超声制成脂质体，但是这种制备方法适合具有极性头部的类脂分子，而对于本研究中的 Cerasome 的类脂分子还没有进行水解，头部也是疏水性的，因此此法也不适合。在本实验中我们综合了上述两种方法，首先在酸性乙醇溶液中进行水解，然后吹干，加入适当的有机分子，用氯仿溶解，制成薄膜，然后加入水
4、溶液震荡超声制成脂质体。一、实验药品与实验仪器1.1 实验药品表 1 主要试剂Tab. 1.1 Key Reagents名称 规格 生产厂家十六烷基溴 99.0% Acros Organics十六烷基胺 99.0% Fluka丁二酸酐 98% Aladdin二环己基碳二亚胺（DCC） 分析纯 吉尔生化（上海）有限公司3-氨丙基三乙氧基硅烷 分析纯 Aladdin异氰酸丙基三乙氧基硅烷 99.0% 东京仁成工业株式会社4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 99.9% Solarbio甲醇 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心无水乙醇 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心三氯甲烷 分析纯 天津市科密
5、欧化学试剂开发中心柠檬酸 分析纯 天津石英钟厂霸州市化工分厂乙腈 分析纯 天津市风船化学试剂有限公司乙酸乙酯 分析纯 天津石英钟厂霸州市化工分厂二氯甲烷 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心柱层层析硅胶 200-300 目 上海五四化学试剂厂二苯甲酮 99.0% Sigma分子筛 4A 1/16 日本和光纯药工业株式会社1.2 实验仪器表 2 实验仪器Tab. 1.2 Experimental instruments仪器名称 型号 生产厂家旋转蒸发仪 BUCHI R-200 瑞士 BUCHI 公司数显可调真空干燥箱 DZF-I50 郑州长城科工贸有限公司电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9123A
6、上海精宏实验设备有限公司集热式恒温磁力搅拌器 DF-101S 河南省巩义市英欲予华仪器厂超声波清洗仪 B5200SDT 大连博信超声设备有限公司循环水式真空泵 SHZ-D() 河南省巩义市英欲予华仪器厂电子天平 Adventurer AR1140 美国 OHAUS 公司核磁共振仪 Varian 400MHz 美国 Varian 公司超纯水机 Milli-Q Academic 美国 Millipore 公司紫外/可见分光光度计 Lambda25 美国 PerkinElmer 公司漩涡振荡仪 Vortex-Genie 2 美国 ScientificIndustries 公司杯式/探头超声仪 Son
7、ifier 250D 美国 BRANSON 公司透射式电子显微镜 JEM-2000EX 日本 JEOL 公司精密 pH 计 S20P 瑞士 Mettler Toledo 公司纳米粒度/Zeta 电位分析仪 SZ-100 日本 HORIBA Scientific 公司薄层硅胶板 Silica gel 60F254 日本 MERCK 公司二、溶剂的精制(1) 甲醇的精制在 500 mL 三口瓶中加入 100 mL 重蒸甲醇溶液及 2.5 g 镁粉，75 下回流二十分钟，然后加入 0.25 g 碘，直至将碘完全反应，冷却，再加入 0.25 g 碘和 300 mL 重蒸甲醇，加热回流 4 h，收集 6
8、465 馏分，将收集的馏分加入分子筛阴凉密闭保存。(2) 三氯甲烷的精制在 500 mL 圆底烧瓶加入 300 mL 三氯甲烷，用刺形精馏柱回流 3 h，收集61 左右馏分（不收集前后馏分），将精制后的三氯甲烷加入分子筛阴暗密封保存。(3) 二氯甲烷(DCM)的精制在 500 mL 的圆底烧瓶中加入 300 mL 二氯甲烷和适量无水氯化钙 50 回流 4 h，收集沸点在 4041 左右的液体（不收集前后馏分）。然后再向收集到的馏分中加入适量氢化钙，在磁力搅拌器上 50 下持续搅拌下继续回流5h，然后蒸馏，收集沸点在 4041 的馏分。在精制后的溶液中加入分子筛，阴凉处密闭保存。(4) 四氢呋喃
9、(THF)的精制在 500 mL 的圆底烧瓶中加入 300 mL 四氢呋喃和适量无水氯化钙 85 回流 4 h，收集沸点在 66 的溶液（不收集前后馏分）。再向收集到的馏分中加入金属钠块和二苯甲酮，在磁力搅拌器上加热至 85 下继续搅拌回流。二苯甲酮为指示剂，当回流过程中发现溶液颜色先由绿色变为蓝色，最终变成深紫色。根据溶液的颜色变化，中间再加几次金属钠块，直到溶液深紫色不变时时继续回流 1h，然后蒸馏，收取沸点在 66 的馏分。在精制后的液体中加入分子筛，阴凉处密闭保存。(5) N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的精制在 500 mL 的圆底烧瓶中加入 300 mL N,N-二甲基甲酰胺和适量氢
10、化钙，减压下回流 3 h，然后减压蒸馏，收集 76 的馏分，将精制后的 DMF 加入分子筛避光密闭保存。 (6) 乙腈的精制在 500 mL 圆底烧瓶中加入 300 mL 乙腈和 15 g 五氧化二磷，加热回流至无色，然后蒸馏，在馏分中加入少量的碳酸钾继续回流，以除去过量的五氧化二磷，最后用分馏柱分馏，收集 81 馏分，加入分子筛避光密封保存。三、 HEPES 缓冲溶液的配置(1) 1 molL-1 NaOH 溶液的配制称取 1 g NaOH 置于干净烧杯中加入适量纯水搅拌至溶解，然后倒入 25 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至 25 mL。(2) pH 7.00 10mmolL-1 HEPES
11、缓冲液的配制称取 1.1915 g HEPES 溶在有 400 mL 蒸馏水的干净烧杯中，搅拌使其充分溶解，用 1 molL-1 NaOH 溶液调 pH 至 7.00，倒入 500 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 500 mL，保存于 4 的冰箱。四、脲型 Cerasome 类脂(EtO) 3SiC3Suc2C16的合成目标化合物： NNHOSiOO(EtO)3SiC3U2C16合成路线：NH2 Br+HNK2CO3(EtO)3Si NCO NHO(EtO)3Si (EtO)3SiC3U216合成步骤：脲型类脂的合成NH2 Br+HNK2CO3(EtO)3Si NCO NHNO(EtO)3Si
12、 (EtO)3SiC3U16受体 4-十六烷氧基-2- 羟基苯甲醛的合成OHOHO NaHCO3/KIOC16H3OHOC16H3Br 丙 酮（1）取 2.76g 2,4二甲基苯甲醛中加入1.68gNaHCO3、3.4gKI、5.6g C16H33Br 混合后加入 300mL 丙酮；（2）在 60油浴中加热回流 40h；（3）趁热过滤除去不溶物；（4）加三氯乙烷溶解，抽滤，旋转蒸发仪蒸干；（5）把处理后的受体加入硅胶搅拌；（6）过柱纯化（洗脱液用氯仿：正己烷=1:1） ；（7）蒸发溶剂得到白色固体即为受体。脂质体的制备及膜上人工受体的嵌入丁二酸型脂质加入调制液在机械搅拌下水解 12 个小时。
13、（调制液比例为脂质：HCl: H2O :EtOH=1:0.03:19:200）水解后采用两种方法进行膜上人工受体的嵌入，分别是注射法和制膜法（超声法） 。方法一：注射法A不加受体：10mL 缓冲液+61L 水解脂质体B. 加受体：10mL 缓冲液 +61L 水解脂质体+10L 受体方法二：制膜法C.不加受体：（1）称取 60.8L 脂质体（吹干） ;（2）加三氯甲烷溶解后旋干成膜放入真空干燥箱中干燥;（3）加入缓冲液 10mL,超声 5 分钟再孵育 12 个小时。D.加受体：（1）称取 60.8L 脂质体（吹干） ;（2）加三氯甲烷和 10L 受体溶解后旋干成膜放入真空干燥箱中干燥;（3）加入
14、缓冲液 10mL,超声 5 分钟再孵育 12 个小时。五、含 Schiff 碱结构人工受体脂质的合成5.1 4-十六烷氧基-2-羟基苯甲醛缩氨基硫脲合成目标化合物： NOHO HNH2S合成路线：HOOHO BrHOOOKHCO3,KIdryacetone, ， 40hNH2NHH2 SEtO,80 HOONH2NS合成步骤：(1) 4-十六烷氧基-2-羟基苯甲醛的合成（按文献 85合成）HOOHO BrHOOOKHCO3,KIdryacetone, ， 40h将 1.38 g（0.01 mol）)2,4-二羟基苯甲醛溶于 250 mL 干燥的丙酮中，搅拌下加入 1.00 g KHCO3（ 0
15、.01 mol）和 1.7 g（0.01 mol） KI，然后加入 2.8 g（0.009 mol）溴代十六烷，加热回流 40 h，趁热过滤除去不溶物，滴加盐酸将溶液调为中性，然后加入 100 mL 氯仿萃取，将氯仿提取液旋转蒸发得到紫色粗产物，粗产品经柱色谱提纯（洗脱液为氯仿/正己烷 (v/v, 1/1) 混合液），旋转蒸发溶剂后真空干燥得到目标产物。取少量产品做核磁共振氢谱检测。 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): d= 11.41 (s, 1H, -CH=O), 9.63 (s, 1H, -OH), 7.35 (d, 1H, aromatic), 6.46(d, 1H, a
16、romatic), 6.34 (s, 1H, aromatic), 3.93(t, 2H, OCH2), 2.101.7 (m, 26H,-CH2-) ,0.81 (t, 6H, CH3)。(2) 4-十六烷氧基-2-羟基苯甲醛缩氨基硫脲的合成HOOONH2NHH2 SHOONH2NS80EtOH将 500 mg(1.38 mmol) 4-十六烷氧基-2-羟基苯甲醛微热溶于 30 mL 无水乙醇，加入 126 mg(1.38 mmol) 硫代氨基脲，80 加热回流 2 h，冷却，抽滤，无水乙醇重结晶，真空干燥的目标产物，产率 84%。取少量产品做核磁共振氢谱检测。 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): d= 11.26 (s, 1H, -OH), 9.92 (s, 1H, -NH-), 8.26(s，1H，-CH=N)，8.03 (d, 1H, aromatic), 7.84,7.80（s，2H，-NH 2
