《【最新】组织培养实验二》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【最新】组织培养实验二（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验二 MS 培养基母液配制与保存一、目的要求学习培养基母液的配制，为培养基的配制做准备。二、基本原理培养基是植物离体培养赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质。在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常将培养基成分首先配制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度按比例稀释。本实验以 MS 培养基为例，学习培养基母液的配制。三、试剂与主要用具1、仪器、用具分析天平(感量 0.01g 和 0.0001g)、药 匙 、 玻 棒 、 称 量 纸 、 吸 水 纸 、 滴
2、管 、 洗瓶 、 标 签 纸 、 烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、200ml、500ml、1000ml）、试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液管、洗耳球、电炉等。2、 试 剂（ 1） 95%乙 醇 、 1mol/L NaOH、 1mol/L HCl。（2）MS 培养基各成分试剂。（3）植物生长调节剂：2，4-D、6-BA、IAA、NAA 等。（4）洗涤剂。四、方法步骤1、大量元素母液的配制按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大 10 倍，按照表中的次序分别准确称量后，分别用 50ml 烧杯，加入蒸馏水 30 ml 溶解（可以
3、加热至 6070，促其溶解）。溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约 50ml 的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用 250mL 容量瓶定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，保存于 4冰箱中待用。MS 培养基大量元素母液（10 倍）的配制剂量母液 化合物名称 培养基用量 （mg/L） 扩大倍数 称取量(mg) 母液体积 (mL)1L 培养基吸取母液量（mL）KNO3 1900 4750NH4NO3 1650 4125MgSO47H2O 370 925KH2PO4 170 425大量元素 CaCl22
4、H2O 440101100250 1002、微量元素母液的配制按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物扩大 100 倍，用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，于 4保存。MS 培养基微量元素母液（100 倍）的配制剂量母液 化合物名称 培养基用量 （mg/L） 扩大倍数 称取量 (mg) 母液体积(mL)1L 培养基吸取母液量（mL）MnSO44H2O 22.3 223ZnSO47H2O 8.6 86H3BO3 6.2 62KI 0.83 8.3Na2MoO42H2O 0.25 2.5CuSO45H2O 0.025 10ml* 微量元素Co
5、Cl26H2O 0.02510010ml*100 10*、*：因天平存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取 2.5g，溶解并定容至 100ml 容量瓶中，然后移取 10ml，加入混合液中。 3、铁盐母液的配制常用的铁盐是 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA 的螯合物，必须单独配成母液。配制时，按照扩大后的用量，分别称取 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA，分别溶解后，将 FeSO4溶液缓缓倒入 Na2-EDTA 溶液(需加热溶解)，搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，并保存于冰箱中。MS 培养基铁盐母液（100 倍）的配制剂量母液 化合物名称培养基用量（mg/L）扩大
6、倍数称取量(mg)母液体积(mL)1L 培养基吸取母液量（mL）Na2-EDTA 37.3 373铁盐FeSO47H2O 27.8 100 278 100 104、有机物母液的配制按照表中各成分浓度扩大后的用量，用感量 0.0001g 天平分别称量各有机物。混合溶解定容，装入试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。MS 培养基有机物母液（100 倍）的配制剂量母液 有机物 名称培养基用量（mg/L）扩大倍数称取量(mg)母液体积(mL)1L 培养基吸取母液量（mL）甘氨酸 2.0 20盐酸硫铵素 VB10.4 4盐酸吡哆醇 VB60.5 5烟酸 0.5 5有机物肌醇 1001001000100 1
7、0一般有机物都溶于水，但叶酸（VBc）先用 1mol/L NaOH 溶液溶解；V H（生物素）先用 1mol/L NaOH 溶液溶解；V A、V D3、V B12应先用 95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。5、激素母液的配制激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般是0.12 mg/ml，根据需要确定配制的浓度。称量激素要用感量万分之一天平。配制激素母液时应注意，各激素的溶剂不同，具体见下表。植物组织培养中常用植物激素、生长调节物质的溶剂中文名 缩写 溶剂2，4-二氯苯氧乙酸 2,4-D NaOH/乙醇吲哚乙酸 IAA NaOH/乙醇吲哚丁酸 IBA NaOH/乙醇-萘乙酸
8、 NAA NaOH/乙醇6-苄基氨基腺嘌呤 6-BA NaOH/HCl激动素 KT NaOH/HCl脱落酸 ABA NaOH玉米素 ZT NaOH赤霉素 GA3 乙醇腺嘌呤 Ade H2O注：称取 10mgNAA 溶解后定容至 100ml，即得到 0.1mg/ml NAA 贮备液。称取 100mg6-BA 溶解后定容至 100ml，即得到 1mg/ml 6-BA 贮备液。6、在配制母液时应注意（1）培养基各试剂应使用分析纯。（2）在称量时应防止药品间的污染，药 匙 、 称 量 纸 不 能 混 用 ， 每种试剂使用一把药 匙 ， 多 出 的 试 剂 原 则 上 不 能 再 倒 回 原 试 剂 瓶
9、 。（3）母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、扩大倍数、配制日期，并存放在 4冰箱中。使用前，要进行检查，若发现试剂中有絮状沉淀或长菌或铁盐母液的颜色变为棕褐色，都不应再使用。五、结果与分析记录本小组配制的培养基母液种类、扩大倍数、母液配制体积、母液中各成分的称取量。MS 大量元素母液的配制:按照 MS 培养基配方的用量扩大 20 倍，将大量元素配制成 20 倍的母液。配制时先用量筒量取蒸馏水 800ml，放入 1000ml 的烧杯中，依次分别称取 KNO3 38g;NH4NO3 33g, MgSO47H2O 7.4g, KH2PO4 3.4g, CaCl22H2O 8.8g，按顺序先后倒入
10、烧杯中，用玻璃棒搅动，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入 1000ml 的容量瓶，用蒸馏水定容至1000ml,然后，倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于 4冰箱保存备用。配制培养基时每升 MS 培养基吸取该母液量为 50ml。MS 微量元素母液的配制:将 MS 培养基配方中微量元素的无机盐用量分别扩大 1000 倍，用电子天平分别依次称取 MnSO44H2O 22.3g， ZnSO47H2O 8.6g , H3BO3 6.2g，KI 0.83g，Na 2MoO42H2O 0.25g，CuSO 45H2O 0.025
11、g，CoCl 26H2O 0.025g，并用重蒸水逐个溶解，待全部溶解用容量瓶定容后，装入 1000ml 倒入细口磨砂试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于 4冰箱保存备用。配制培养基时每升 MS 培养基吸取该母液量为 1ml。铁盐母液的配制:在电子天平上准确称量 2.78g 硫酸亚铁(FeSO 47H2O)和 3.73g 乙二胺四乙酸钠(Na-EDTA),分别倒入盛有 400ml 蒸馏水的烧杯中，微加热并不断搅拌使之全部溶解。将两种溶液倒入同一个 1000ml 的容量瓶中，混合均匀后，用蒸馏水定容至 1000ml，并倒入棕色磨口试剂瓶中，经室温放置一段时间令其充分反应后
12、，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名、置于 4冰箱保存备用。如果将新配制的铁盐母液立即放入冰箱中。则会容易形成沉淀。配制培养基时，每配制 1000mlMS 培养基吸取此母液 10ml。MS 有机母液的配制:用电子天平依次称取：肌醇（环己六醇）5000mg，盐酸硫胺素（维生素 B1）5mg，烟酸 25mg，甘氨酸 100mg，盐酸吡哆醇（维生素 B6）25mg，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入 500ml 的磨口瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于 4冰箱保存备用。配制培养基时，每配制 1LMS 培养基吸取该母液 10ml。植物生长物质母液的配制:2,4-D 母液：准
13、确称量 2,4-D 50mg，先用 13ml90%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容；也可以用少量碱（如 1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）溶液，使之中和成为钠盐或钾盐，在水中溶解，再加水定容至 100ml，即配成浓度为 500ml/L 的母液。贴上标签，注明名称、浓度和配制日期，放入 4冰箱保存。NAA 母液的配制过程与 2,4-D 相同。6-BA 母液：准确称量 50mg 6-BA，加入少量碱溶液（如 1mol/氢氧化钾、氢氧化钠）或稀碱液（1mol/L 盐酸）溶液使之完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为 500mg/L 的 6-BA 的母液。转入磨口试剂瓶中，并贴上标签，注明母液名
14、称、浓度和配制日期，放入 4冰箱保存备用。1、大量元素母液的配制先用量筒称量适当蒸馏水放入 500ml 烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , MgSO47H2O, CaCl22H2O，待第一种化合物完全溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至 500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至 500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。2、微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平依次称取 MnSO44H2O, ZnSO47H2OH3BO3, KI, Na2MoO42
15、H2O，CuSO 45H2O, CoCl26H2O,按制备母液 I 的方法逐个溶解，转移至容量瓶中，然后定容至 500ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。3、铁盐母液的制备把 FeSO47H2O 和 Na2-EDTA 分别置于适量蒸馏水中，加热搅拌使之完全溶解，保持加热，把 FeSO4倒入 Na2-EDTA 溶液中并搅拌，接近沸腾时停止加热，冷却后调 PH 到 5.5，将溶液转移至 500ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至 500ml，转入细口试剂瓶中，用力振荡 12min，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。4、有机化合物母液的制备按配方表中用量依次称取：维生素 B, 烟酸, 甘氨酸，用蒸馏水溶解后定容后，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。5、植物生长物质母液制备NAA 母液:准确称取 10mg,用少量 1mol/L NaOH 溶解后加蒸馏水定容至 100ml,即配制成 0.1mg/ml 的 NAA 母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。6BA 母液配制方法相似，浓度为 2mg/ml。
