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1、分类号 S511 学 号 2008201008 博士学位论文水稻显性矮秆基因Epi-df的图位克隆、表观修饰特征分析及功能研究张 立 国指导教师万建民 教授专业名称遗 传 学研究方向水稻分子遗传答辩日期二一二年十二月POSITIONAL CLONING, EPIGENETIC MODIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSES OF A DOMINANT DWARF GENE OF Epi-df IN RICE (ORYZA SATIVA L.)ByZhang LiguoA dissertation submitted toNanjing Agricultural Uni
2、versity In Partial Fulfillment of the Requirements for Doctoral Degree SupervisedByProfessor Wan JianminDepartment of Crop Genetics and Breeding Nanjing Agricultural University Nanjing 210095, P.R.ChinaDecember 2012原 创 性 声 明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或
3、撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。 （请在以上方框内打“”）学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日导师（需亲笔）签名： 年
4、月 日目 录摘 要IABSTRACTIII缩略词V第一章 文献综述11 水稻株高的研究概况11.1 水稻矮化突变体的遗传研究进展11.2 水稻矮化机制的研究进展21.3 水稻显性矮秆突变体的研究进展62 植物表观遗传调控的分子机制72.1 表观遗传学的定义和研究内容72.2 DNA甲基化72.3 组蛋白修饰132.4 表观遗传学的研究方法172.5 表观等位基因的克隆193 PcG蛋白介导的基因沉默与植物发育203.1 PcG蛋白复合体的组成和分类213.2 PcG蛋白与TRX蛋白的相互拮抗223.3 PcG蛋白介导的H3K27me3修饰的建立、维持以及识别233.4 PcG蛋白对植物发育的调
5、控254 本研究的目的和意义27第二章 水稻Epi-df突变体的表型及遗传分析291 材料与方法291.1 实验材料与田间种植291.2 Epi-df降秆能力调查301.3 Epi-df花器官突变、花粉育性以及结实率调查301.4 Epi-df遗传规律和回复突变调查302 结果与分析302.1 Epi-df表型分析302.2 Epi-df花器官变异及育性分析312.3 Epi-df降秆能力分析342.4 Epi-df遗传规律分析343 讨论373.1 Epi-df具有潜在的育种利用价值373.2 Epi-df遗传稳定但存在低频率的回复突变38第三章 水稻显性矮秆基因Epi-df的图位克隆及转基
6、因验证391 材料与方法391.1 实验材料与田间种植391.2 DNA提取401.3 PCR分析401.4 分子标记设计411.5 基因定位411.6 候选基因预测和测序421.7 RNA提取、RT-PCR及Real-time PCR421.8 转基因互补载体的构建421.9 转基因过表达载体的构建431.10 农秆菌介导的遗传转化431.11 转基因阳性植株的鉴定432 结果与分析442.1 初定位和精细定位442.2 候选基因分析452.3 候选基因的测序和表达分析462.4 转基因验证473 讨论493.1 Epi-df突变表型来自FIE1基因的异位表达493.2 FIE1异位表达可能
7、是由表观突变导致的50第四章 水稻FIE1基因的表观遗传修饰及功能分析511 材料与方法521.1 DNA甲基化分析521.2 亚硫酸盐法DNA甲基化测序531.3 染色质免疫共沉淀（ChIP）531.4 生物信息学分析531.5 胚乳RNA提取、RT-PCR及Real-time PCR531.6 印记分析541.7 酵母双杂交分析541.8 Microarray分析552 结果与分析552.1 FIE1基因DNA甲基化分析552.2 FIE1基因位点组蛋白H3K9me2和H3K4me3分析602.3 FIE1基因结构及蛋白同源分析612.4 FIE1基因表达模式分析642.5 FIE1基因印
8、记分析662.6 FIE1蛋白与水稻E（z）类蛋白互作682.7 FIE1基因异位表达对靶基因H3K27me3修饰的影响693 讨论713.1 Epi-df是水稻中发现的第一个DNA去甲基化表观突变体713.2 FIE1的胚乳特异性表达和印记模式受DNA甲基化调控723.3 FIE1蛋白参与PcG蛋白复合体PRC2介导的转录抑制733.4 水稻中PRC2介导的H3K27me3修饰途径受H3K9me2的调控74第五章 全文讨论与结论751 讨论751.1 Epi-df具有自身的表观遗传学特征751.2 表观遗传修饰对水稻两个FIE基因的功能分化起重要作用751.3 水稻H3K27me3的正常功能
9、依赖于H3K9me2对FIE1的转录抑制762 结论762.1 Epi-df是一个降秆能力较强的显性矮秆突变体762.2 Epi-df的表型是由FIE1基因的表观遗传突变导致的762.3 FIE1的表达模式和印记特征受表观遗传修饰调控772.4 FIE1参与PRC2介导的基因沉默783 本文创新之处78参考文献79附 录97在读期间发表的论文109致 谢111水稻显性矮秆基因Epi-df的图位克隆、表观修饰特征分析及功能研究摘 要株高是与产量相关的重要农艺性状，株高超过一定范围容易引起倒伏而减产，矮秆不仅有利于抗倒伏，而且耐贫瘠，有利于提高产量。20世纪50年代末开始的矮化育种，使水稻株高降低
10、至半矮秆，水稻单产获得了第一次飞跃，成为“绿色革命”的标志性成就之一。目前正在进行的超级稻育种主要利用理想株型和籼粳亚种间杂种优势以期水稻单产得到进一步提高。迄今水稻育种中利用的矮秆基因都是隐性基因，杂交水稻育种中隐性矮秆基因的使用往往要求双亲必须具有同一矮秆基因，这就限制了在更广泛的资源中选择有利亲本。但是如果利用显性矮秆基因，则能够使水稻种质资源得到更有效的利用和缩短育种时间。因此发掘新的水稻株高控制基因特别是显性矮秆基因，对进一步提高水稻单产具有重要意义。本研究对显性矮秆突变体Epi-df进行了系统的表型考察和降秆能力分析，并对产生矮化的分子机制进行了深入研究。主要研究结果如下：（1）E
11、pi-df从苗期至成熟期表现矮化，并且与野生型杂交F1表现类似突变体的表型，因此，Epi-df属于显性矮秆突变体。Epi-df与籼稻品种培矮64正反交F1株高介于两者之间，F2代分离群体中高株和矮株数比例接近1：3，表明Epi-df表型是由单显性核基因控制。将Epi-df与3个籼稻品种和3个粳稻品种杂交，降秆率介于16.3%至50.4%之间，表明Epi-df具有较强的降秆能力，有望在水稻籼粳交杂种优势利用育种中得到应用。（2）利用图位克隆方法将突变基因精细定位在49kb区域内，但并未发现DNA序列突变，却发现其中的ORF5在突变体中表达强烈，而在野生型中沉默。Epi-df还存在另外一个特征，即
12、虽然表现遗传稳定但存在低水平的回复突变频率，因此ORF5的异位表达可能是由表观遗传变异引起的。DNA甲基化测序结果表明FIE15端发生了DNA去甲基化，这与FIE1的异位表达是一致的。尽管FIE1在回复突变株中保持沉默，但DNA甲基化并未恢复到野生型水平，发生恢复的位点主要集中在转录起始点附近和第3个外显子。另外，Epi-df中FIE15端H3K9me2水平下降，而H3K4me3水平上升，这与FIE1基因的异位表达和DNA去甲基化是一致的。因此，Epi-df是一个表观遗传突变体，这为研究表观遗传修饰对单子叶植物尤其是重要作物的生长发育的调控提供了重要材料。（3）FIE1是胚乳特异性表达的基因，
13、并且具有仅母本表达的印记特征。FIE1在叶片、茎和幼穗中存在高水平的DNA甲基化，而在受精后第6、9和12天的胚乳中甲基化水平严重降低，并且F1胚乳中母本FIE1的DNA甲基化水平比父本低很多，因此FIE1的表达模式和印记特征受DNA甲基化调控。与拟南芥仅有一个FIE基因不同，水稻含有两个FIE基因，另一个FIE基因FIE2是组成性表达的，因此我们推测水稻基因组复制以及随后的进化过程中，表观遗传修饰对两个FIE基因的功能分化起了重要作用。（4）酵母双杂交结果表明FIE1与iEZ1以及CLF互作，表明FIE1参与水稻中PRC2介导的转录抑制。基因芯片分析发现Epi-df中有305个基因的表达发生
14、了改变，其中222个基因下调，83个基因上调。利用染色质免疫共沉淀技术发现这些表达量改变的基因同时伴随着H3K27me3修饰的改变。因此，FIE1的异位表达导致靶基因H3K27me3修饰水平和表达量的改变，从而使Epi-df表现突变表型。（5）H3K9me2和H3K27me3是与转录抑制相关非常保守的两种表观遗传修饰， H3K9me2主要集中在异染色质，起抑制转座子和逆转座子转录和转座的功能；H3K27me3基本存在于常染色质，起抑制基因转录和维持细胞记忆的功能。染色质免疫共沉淀分析表明FIE15端存在高水平的H3K9me2，而Epi-df中H3K9me2水平降低引起FIE1异位表达和基因组水平上H3K27me3分布异常，从而导致水稻发育缺陷。因此，H3K9me2控制的FIE1转录抑制对水稻中H3K27me3的正常功能是必需的。关键词：水稻；显性矮化；FIE1；表观遗传突变；H3K9me2；H3K27me3POSITIONAL CLONING, EPIGENETIC MODIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSES
