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1、书 山 有 路文献综述题 目 流感病毒分子的研究进展学生姓名 李朝阁专业班级 生物技术学 号 540903030123院 系 食品与生物工程学院指导老师(职称) 孙新城完成时间 2011年12月56 日流感病毒分子研究进展摘要2010年全世界爆发了一场影响空前的流感，甲型H1N1流行性性感冒病毒从美国，墨西哥传出，席卷了整个人类社会，回顾以往大规模流感爆发事件。西班牙流感，亚洲流感，禽流感等给全世界人们带来了恐慌，甚至死亡，科学在进步，社会的医疗水平在提高，但流感病毒无时无刻在进行着变异，因此我们需要深入了解这种可怕病毒的分子机构、功能组成、复制方式、致病机制，并对其预防免疫，使人类在此面对流
2、感变异病毒是能够及时治疗。关键词 流感 病毒繁殖 病毒检测 致病机制 分子结构AbstractSummary of a an unprecedented impact of flu broke out worldwide in 2010, influenza of pandemic influenza virus from United States, Mexico broke, swept the whole human society, Recalling previous pandemic flu outbreak. Spain influenza, Asia influenza, av
3、ian influenza, to world people brings has panic, even death, science in progress, social of medical level in improve, but influenza virus all in for with variation, therefore we needs in-depth understanding this terrible virus of molecular institutions, and function composition, and copy way, and pa
4、thogenic mechanism, and on its prevention immune, makes human this face influenza variation virus is can timely treatment.Keywords influenza virus virus propagation Virus Detection Pathogenic mechanism Molecular structure1、引言流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气
5、迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。病毒最早是在1933年由英国人威尔逊史密斯（Wilson Smith）发现的，他称为H1N1。H代表血凝素；N代表神经氨酸酶。数字代表不同类型。流感是由流感病毒引起的人畜禽共患的感染性疾病。流感病毒传染性强，传播速度快，在人类历史上曾引发多次大流行，夺去了大量人的生命。流感是人类最大的瘟疫。流感危害养殖业的发展，造成养禽业毁灭性灾害。加强流感病毒基础理论研究，从分子水平上寻求防治流感的有效措施，研制长效、稳定、无毒副反应的新型流感疫苗，建立简便、特异、敏感的诊断技术及有效的抗病毒药物，已成为各国科技工作者孜孜以求的崇高事业。2、流感病毒的研究2. 1
6、、流感病毒的基因结构及其编码的蛋白流感病毒属正黏病毒科。呈多形性，有球形、杆状和丝状。甲型和乙型流感病毒的基因组由8条独立片段组成。每一条RNA基因都以核糖核蛋白复合体形式存在。每个片段两端都有相对保守的非编码序列，每个片段至少有一个开放式读码框架(ORF)。基因片段5端前的13个核苷酸高度保守，其序列为：3-GGAACAAAGAUGAppp-5，3端也有12个高度保守的核苷酸，序列为：3-HOUCGUCUuuCGUCC-5，o流感病毒基因组编码10种蛋白：基因片段l-PB2、片段2PB1、片段3PA、片段4HA、片段5-NP、片段6NA、片段7-M、片段8NS。基因片段1一6分别编码流感病毒
7、结构蛋白，片段7编码基质蛋白。片段8编码非结构蛋白。结构蛋白又有糖基化和非糖基化之分。糖基化结构蛋白包括HA和NA，其余均为非糖基化结构蛋白。HA糖基化位点和裂解位点的突变，可能导致病毒毒力根本性改变。流感病毒基因组RNA片段与RNA聚合酶亚单位PB1、PB2、PA以及核蛋白NP相互作用，组成核糖核蛋白(RNP)复合体。RNP与基质蛋白(M)形成核衣壳，构成流感病毒核心。中层为蛋白壳，含有Ml和M2。外层为双层类脂囊膜。囊膜上有HA、NA和M2构成不同形状的纤突。在每条基因片段靠近5端1521位核苷酸处有一保守区。基因片段5端和3端反向互补形成锅柄结构。这些结构参与病毒RNA的复制和mRNA转
8、录，在RNA聚合酶结合活性、启动子活性和激活内切酶活性中具有重要作用，是流感病毒复制、转录、包装的重要调控成分。2.2流感病毒的遗传变异流感病毒袭击人体时，病毒首先吸附在鼻腔或咽喉内壁细胞上。在病毒和宿主细胞表面都有受体。受体相匹配时，病毒才能吸附在细胞上。然后宿主细胞将吸附的病毒吞噬。病毒基因从壳体蛋白释放。宿主细胞对病毒基因进行加工和改造，形成新的壳体蛋白。病毒在胞核内复制，通过质膜或细胞器膜芽生形成成熟的病毒颗粒。壳体蛋白构成病毒壳体结构，保护病毒。禽流感和马流感病毒的受体为唾液酸d-2。3乳糖苷(a2，3-galactose-8ialic acid)，人流感病毒的受体为唾液酸位-2，6
9、一半乳糖苷。猪的呼吸道黏膜细胞表面具有这两种受体，对流感病毒这两种受体都具有亲和力H。因此，猪能感染人、禽、马。猪流感病毒又能感染人禽马。猪是禽流感和人流感病毒的中间宿主和基因混合器。禽流感病毒在猪体内适应后获得了感染人的能力。猪可能成为人流感病毒的储存宿主。人流感病毒亚型在人群中消失后，可在猪群中潜伏下来，成为人流感病毒的潜在传染源。新近研究表明，人呼吸道黏膜除表达唾液酸口-2，6一半乳糖苷外，下呼吸道黏膜也表达唾液酸a-2，3-半乳糖苷，为禽流感病毒跨种系传播提供了分子病毒学依据。在禽体内，能分离到各种亚型病毒的HA和NA。流感病毒能在鸭的肺和肠道复制，但自身症状并不明显，通过野鸭迁徙到处
10、传播病毒。鸭是流感病毒最大的储存宿主，构成庞大的流感病毒基因库，是造成流感大流行的根源。在禽类不同个体之间。不同品种之间，流感病毒可以相互传播。在同一种群，可同时感染两种或两种以上亚型的流感病毒，存在双重或多重感染的可能，这为流感病毒基因重组提供了有利条件。甲型流感病毒HA在水解成HA1重链和HA2轻链后，才具有感染性。大多数流感病毒HA在禽类体内不水解，对禽类不致病。人流感病毒的HA具有高度水解性。人类和禽类流感病毒基因重组后，导致HA水解活性改变，对禽类致病性也发生了改变，由不致病到致病，由低致病性到高致病性的改变。流感病毒的变异有一定规律，有周期性。甲型流感病毒适应能力极强，病毒基因容易
11、发生变异。编码HA的基因片段突变率最高。RNA核苷酸序列变化较小的，称为抗原漂移。在流感病毒演化过程中，病毒RNA核苷酸序列发生了变化，其编码的氨基酸序列随之发生改变。当核苷酸序列的变异达到一定程度，导致病毒抗原决定簇改变，抗原性发生了变化。病毒的抗原变异帮助了病毒逃避宿主的免疫反应。抗原漂移出现的频率很高，并有逐渐累积效应。当变异达到一定程度后，可形成新的病毒株。人群对新的病毒株不再具有免疫力，从而出现疾病地区性流行。RNA核苷酸序列变化显著，称为抗原转换。抗原转换往往伴随病毒RNA基因交换重组。人类流感病毒能感染多种动物。在动物体内，人类和动物流感病毒的遗传信息进行交换与重组。重组后的新型
12、病毒再重返人类。当两种或两种以上亚型的流感病毒感染同一宿主细胞时，不同种类流感病毒的基因组片段可以随机重新组合，理论上能产生256种在遗传学上不同的子代病毒，其中不乏对人高致病性毒株。2.3流感分子流行病学研究流感的世界性大流行是由于流感病毒变异和人群免疫屏障相互博弈的结果。流感流行后，人群获得了相应免疫，流感暂时在人间销声匿迹。病毒变异逃脱了人群免疫屏障，病毒新亚型出现，导致新的流感流行。在近代史上，曾发生数次流感世界性流行和较凶险流行。比较严重的有西班牙流感、亚洲流感、香港流感、禽流感、甲型H1N1流感等3流感病毒分子生物学检测技术传统的流感实验室诊断技术有病毒分离鉴定、电镜观察、血清学试
13、验和免疫学试验。这些诊断技术检测周期长，灵敏度低，特异性差。分子生物学检测技术方法简便，快速，灵敏度高，特异性强。主要的技术手段有：3.1全基因克隆序列分析收集流感病毒的鸡胚尿囊液，超速离心，提取RNA。用RT-PCR扩增病毒HA的互补DNA。加A尾，连接PGEMTE柏y载体，转化DH5a感受态细胞。提取质粒DNA，用Eco RI酶切鉴定，筛选阳性克隆，对目的片段进行序列测定。对世界各地分离的流感毒株进行核苷酸测序，通过DNASTAR软件序列分析，并与GenBank的禽、人、猪流感病毒核苷酸同源性分析和氨基酸形成的进化树比对分析，分析这些毒株不同谱系和遗传变异3.2核酸分子杂交技术(nucle
14、ic acid hybridization )用于流感病毒检测的是探针技术。对探针进行同位素、荧光素、生物素、酶或地高辛(DIG标记，再与病毒基因组杂交，通过标记物进行杂交信号检测。将常规PCR、核酸杂交和信号放大结合，能检测甲型流感病毒M、HA和NP基因。比常规PCR敏感、特异。Taqman探针RT-PCR是Taqman探针5端标记一个荧光分子，3端标记一个荧光淬灭分子。当探针完整时，两者发生荧光共振能量传递(FRET)。PCR扩增时，由于Taq酶5：3外切酶活性，将探针水解，使荧光分子和淬灭分子间距增大，荧光监视系统检测到荧光信号。3.3逆转录-聚合酶链反应提取样品RNA，经过多次变性、退
15、火、延伸，实现基因片段扩增。通过琼脂糖凝胶电泳、探针杂交或序列分析对扩增产物进行检测。选择NP或M基因保守序列作为靶序列。亚型诊断选择不同亚型HA基因保守序列作为靶序列。设计特异性引物，作出定性诊断。3.3.1实时荧光定量PCR技术根据流感病毒NP基因序列，合成引物和相应的Taqman助探针。从流感病毒培养液中提取总RNA，经RTPCR扩增NP基因。经鉴定，将NP基因克隆入PGEM-T ea8y载体，转化大肠杆菌JMl09，经PCR和测序，获得阳性重组质粒。为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线，建立荧光定量PCR反应体系。332 套式RTPCR(RTnested PCR)按照流感病毒NP基因
16、保守区域，设计一对外引物和一对内引物，检测病毒核酸。方法简便、快速、敏感、特异。333 RTPCR-ELISA具有RT-PCR的敏感性、核酸杂交的特异性和EllSA的酶联放大作用。检测结果更敏感、准确。4 综述综上所说，我们对流感病毒的分子结构、遗传变异、以及生物学检测手段进行了详细的阐述，使我们对流感病毒有了详细的认识，为人类了解、预防、及有效的治疗流感病毒提供了科学依据，诸多历史证明，流感病毒极其容易变异，目前为止我们还无法准确预测其变异特性，我们只有养成良好的生活健康习惯，掌握相关的免疫知识，积极参加锻炼，有效的控制流感病毒传播途径，就能对性流行感冒病毒及时的防御，相信随着科学技术的进步，人们对这种病毒属性会更加清醒的认识，流感
