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1、 1实验室设置及仪器设备 2实验基本操作 3培养基的成分及其配制 4培养条件的选择 植物细胞工程实验室及基本操作 1实验室设置及仪器设备 实验室是进行组培研究的主要场所 应能满足清洗 培养基制备 储藏 无菌操作 培养 鉴定等多方面的工作 1 基本实验室 1 1洗涤间根据工作量的大小决定其大小 一般面积控制在30 50m2 在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽 用来清洗玻璃器皿 中央实验台还应配置2个水槽 用于清洗小型玻璃器皿 如果工作量大 可以购置一台洗瓶机 准备1 2个洗液缸 专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿 此外还应配置落水架 干燥箱 柜子 超声波清洗器等 地面应耐湿并排水良好 面积60
2、平方米左右 配备的主要仪器设备有 冰箱 天平 微波炉 pH计 培养基分装器 药品柜 器械柜 抽气泵 电炉 各种规格的培养瓶 培养皿 移液管 烧杯 量筒 容量瓶 储藏瓶等 冰箱以体积180 200L为宜 用于储存培养基母液 激素维生素等贵重药品 彩色胶卷 及保存植物材料 天平应有不同感量 1 2培养基配制间 配备实验台 高压灭菌锅 排风灭火设备 细菌过滤设备 干热消毒柜 电炉等 灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅 一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅 较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅 生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅 如果没有条件的话 可以将上述工作间合并
3、成一个准备间 要求是设备的安装和排列要合理 房间要宽敞 明亮 透风 地面要便于清洁 防滑 1 3消毒间 无菌操作室主要用于实验材料的接种操作 所以又叫接种室 通常由里外两间组成 外间是缓冲间 用于准备工作 还有防止污染的作用 缓冲间的门应该与接种室的门错开 两个门也不要同时开启 以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌 缓冲间内应该设有水槽 实验台 鞋帽架 和柜子 紫外灯 无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修 工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋 室内应配有超净工作台 紫外灯 解剖镜 各种接种器械等 1 4无菌操作室 为了控制培养室的温度和光照时间及其强度 培养室的房间不要窗户 但应
4、当留一个通气窗 并安上排气扇 室内温度由空调控制 光照由日光灯控制 天花板和内墙最好用塑料钢板装修 地面用水磨石或瓷砖铺设 一般要分两间 一为光照培养室 一为暗培养室 培养室外应有一预备间或走廊 培养室应配有培养架 转床 摇床 光照培养箱 生化培养箱 自动控时器等 日光灯一般用40W 固定在培养架的侧面或搁板的下面 每层有两支日光灯 距离在20cm 光照强度为2000 3000lx 1 5培养室 2 辅助实验室 2 1鉴定室细胞学鉴定室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究 要求清洁 明亮 干燥 使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染 应配置各种显微镜 照相系统等 生化分析室在以培养细胞产物为主要目
5、的的实验室中 应建立相应的分析化验实验室 以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查 离心机 酶联免疫检测仪 天平 PCR仪等 为试管苗提供满足生长的适宜环境条件 2 2 温室 1 洗涤液的配制 2实验基本操作 一 洗涤技术 A 新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质 可先用0 5 的去污剂洗刷 再用自来水洗净 然后浸泡在1 2 盐酸溶液中过夜 不可少于四小时 再用自来水冲洗 最后用无离子水冲洗两次 在100 120 烘箱内烘干备用 2 洗涤方法 先用自来水洗刷至无污物 再用合适的毛刷沾去污剂 粉 洗刷 或浸泡在0 5 的清洗剂中超声清洗 比色皿决不可超声 然后用自来水彻底洗净去污剂 用无离
6、子水洗两次 烘干备用 计量仪器不可烘干 清洗后器皿内外不可挂有水珠 否则重洗 若重洗后仍挂有水珠 则需用洗液浸泡数小时后 或用去污粉擦洗 重新清洗 B 使用过的玻璃仪器的清洗 聚乙烯 聚丙烯等制成的塑料器皿 在生物化学实验中已用的越来越多 第一次使用塑料器皿时 可先用8mol L尿素 用浓盐酸调pH 1 清洗 接着依次用无离子水 1mol LKOH和无离子水清洗 然后用10 3mol LEDTA除去金属离子的污染 最后用无离子水彻底清洗 以后每次使用时 可只用0 5 的去污剂清洗 然后用自来水和无离子水洗净即可 C 塑料器皿的清洗 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤 新的可以用热洗衣粉水洗净 需
7、要清洗时 一般用酒精擦洗 然后火焰干燥 E 除菌过滤器用清水冲洗后 用洗液冲洗 再用清水冲洗 最后用蒸馏水冲洗 晾干备用 D 金属用品洗涤 一 灭菌工作是极其重要的 首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴 有菌 凡是暴露在空气中的物体 至少其表面都是有菌的 如植物的表面 超净工作台的台面 未处理的工具和手等 无菌 高压高温处理 工具 器皿 培养基等 物理或化学处理 火烤后的物体 健康的动植物不与内外部表面接触的组织内部可能是无菌的 有时也有内生菌 但不会影响培养 也不会污染 二 灭菌 1 物理方法 干热 湿热 过滤 0 25微米 紫外灯 超声波等 2 化学方法 使用灭菌剂或抗菌素 如酒精 次氯酸
8、钠 升汞 漂白粉 高锰酸钾 双氧水 福尔马林等 二 灭菌的方法 干热灭菌玻璃器皿 器械湿热灭菌培养基 蒸馏水 器械 棉塞等熏蒸灭菌接种室 培养室过滤灭菌液体培养基 蒸馏水药剂灭菌培养材料烧灼灭菌器械 瓶口 棉塞 包头纸辐射灭菌接种室 培养间 各种灭菌方法及其使用范围 适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌 操作方法 150 40min或120 120min 如果发现芽孢杆菌 160 90 120min 1 干热灭菌 适用于各种器皿 培养基 器皿 蒸馏水 棉塞 纸等 121 维持20 30min注意点 加足水 排尽气 气压降到0时 才能开盖 2 湿热灭菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理 但如果培养基中某
9、些成分遇到高温分解 如某些生长调节剂GA3 玉米素等 就需要过滤灭菌 另外酶 血清等也需要过滤灭菌灭菌方法 将生长调节剂或酶配成一定浓度 用注射器注入微孔滤膜虑 滤膜孔径0 22 0 45微米 制培养基时 现将培养基高压灭菌 待降至50 左右时 加入适量的激素 然后分装 3 过滤灭菌 主要是利用紫外灯进行照射 适合实验室空气 操作台等 灭菌时间20 30min 注意 关灯后5min后再进入 超净工作台关灯后要打开风机 4 射线灭菌 用火焰灼烧达到灭菌目的 适用于接种器皿的灭菌 5 火焰灼烧灭菌 适用外植体 实验器皿 操作表面 皮肤等 几种常用消毒剂的效果比较 6 消毒剂 长期不用的培养室或接种
10、室要进行熏蒸 方法 甲醛 高锰酸钾熏蒸 甲醛的用量通常按每立方米空间2 6毫升计算 高锰酸钾的用量是甲醛的一半 室内准备妥当后 把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内 最好在碗或杯下面铺一张报纸 以利清洗 然后将甲醛也倒入碗或杯内 立即出屋关门 几秒钟后 甲醛溶液即沸腾挥发 高锰酸钾是一种氧化剂 当它与一部分甲醛作用时 由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体 熏蒸灭菌 甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行 熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作 甲醛对人的眼 鼻有强烈刺激作用 因此 可在使用前用氨进行中和 取与甲醛等量的氨水 倒在另一个烧杯里 迅速放入熏蒸室内 使甲醛和氨水发生中和反应 以消
11、除甲醛味 减少对人体的刺激作用 使用氨水应在工作前2小时进行 对有材料的培养室 也可以采用乙二醇加热熏蒸 人为因素 工作人员本身 工作服 帽 口罩 酒精擦手 物品因素 器皿和用具 培养皿 洗 热压玻璃器皿 洗 干热 干热箱 或晾干接种用具 用CCL4布擦 湿布擦 泡75 95 酒精 烧 培养基 湿热 培养材料 外部细菌 用水冲洗 化学药剂处理内部细菌 茎尖培养加抗生素 青霉素 利福平 操作的空气 洗刷地板95 酒精擦超净工作台用化学试剂薰蒸 污染来源 三 无菌操作技术 1 实验器具和材料的准备2 用75 的酒精擦拭超净工作台 然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min 30min 注意 台面上
12、的用品不要放置太多或重叠放置 以免降低灭菌效果 3 关紫外灯 打开风机 过5 10min进入缓冲间 以75 洗手和手臂 更换无菌服 帽子和口罩 进入接种室 注 没有特别情况 尽量不要下工作台 4 用70 75 的酒精拭擦台面并消毒双手 试验用具也应该用酒精消毒 点燃酒精灯 将金属器械在其火焰上灼烧 冷却待用 注意 所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行 金属器械不能过度灼烧 以防退火 移液管不能灼烧 培养瓶口 塑料材料 橡胶材料过火焰不能时间太长 5 取流水冲洗 至少30min 过的外植体 用一定的消毒剂浸泡消毒 用无菌水冲洗3 4次 放入无菌培养皿中 置于酒精灯火焰下方 用无菌的接种器械进行分离
13、 切割或其他处理 6 打开培养瓶 瓶口在灯焰处旋转灼烧 用镊子将培养材料置于培养基上 灼烧镊子放回 灼烧瓶口 盖上瓶塞 7 用酒精擦洗工作台和手 进行下一轮操作 注意 1 进行培养时 动作要准确敏捷 但又不必太快 以防空气流动 增加污染机会 2 不能用手触及已消毒器皿 如已接触 要用火焰烧灼消毒或取备品更换 3 为拿取方便 工作台面上的用品要有合理的布局 原则上应是右手使用的东西放置在右侧 左手用品在左侧 酒精灯置于中央 4 工作由始至终要保持一定顺序性 组织或细胞在未做处理之前 勿过早暴露在空气中 同样 培养液在未用前 不要过早开瓶 用过之后如不再重复使用 应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会
14、5 吸取营养液 细胞悬液及其它各种用液时 均应分别使用吸管 不能混用 以防扩大污染或导致细胞交叉污染 6 工作中不能面向操作区讲话或咳嗽 以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染 7 手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方 瓶口最易污染 加液时如吸管尖碰到瓶口 则应将吸管丢掉 接种时在近火焰处打开瓶口 使瓶倾斜 以免空气中微生物落入瓶中 正确错误 整个接种操作应在近火焰处进行 且动作要迅速 正确错误 接种过程中尽可能达到悬空要求 防止操作带来的污染 正确错误 接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口 正确错误 瓶盖朝上放 接种完毕后立即盖好瓶口 正确错误 接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生 种
15、子和分生组织 培养时通常将其贴放在培养基表面 而不是插到培养基内部 以免供氧不足 正确错误 接种茎段 注意形态学下端插入培养基内 而形态学上端露于空气中 正确错误 用于外植体分离的母体植物材料一般有3种来源 一是生长在自然环境下的植物 二是在温室控制环境条件下生长的植物 三是无菌环境下已经过离体培养的植物 四 外植体的选择与处理技术 1 选择优良的基因型试验首先要明确目的 例如 蔬菜 作物等的脱毒快繁 是为了脱去病毒 提高产量和质量 就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料 并且品种一定要可靠 花卉 观赏植物的快繁 也应选择有价值的植物 2 取材从生长旺盛 健壮 无病虫害的植株上取材
16、 母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强 试验容易成功 一 外植体的选择 3 外植体大小选择因外植体不同而不同 如利用茎尖培养 茎尖大小对脱毒效果非常明显 再如幼胚培养 胚龄也非常重要 以后具体讲 4 选择外植体的时期外植体的生长动态往往与该物种的生长规律 生物钟 有关 因此 最好在植物生长的最适宜时期取材培养 会得到较好的结果 1 取材母株的预处理人工管理 促进母株生长旺盛 代谢活跃 从其上取材培养 容易成功 2 外植体休眠的处理有些植物的种子 幼胚 或芽 存在休眠 为了打破休眠 可利用低温处理 或赤霉素等化学物质处理 因植物不同处理温度和时间有所不同 二 外植体的处理 3 组织内生菌的处理 1 加入抗生素 注意抗生素的用量 高浓度容易造成培养物的死亡 2 取生长期旺盛的生长点部位作为起始培养的外植体 3 取被内生菌污染的培养物的茎尖不停的转接 3 培养基的成分及其配制一 培养基的成分及其作用 一 无机营养物质培养的植物组织 器官 细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质 除了C H O之外 需要量比较多的元素叫大量元素 需要量比较少的元素叫微量营养元素 培养基的大量元素使用量一
