《流式细胞术实验方法(周期凋亡表面抗原等)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《流式细胞术实验方法(周期凋亡表面抗原等)（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、流式细胞术实验方法流式细胞术实验方法 PI PI 染色染色操作操作步骤步骤 1 将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中 离心 1500rpm 5min 弃上清液 2 加入 PBS 1ml 离心洗涤 1 次 弃上清 3 加入 2ml 预冷的 70 酒精 4 固定 30min 或是 20 固定过夜 4 离心 弃上清液 5 用 1 PBS 1ml 洗涤 1 次 离心 6 加入 RNase A 工作浓度 20ug ml 于 500ul 1 PBS 中 37 孵育 30min 离心 7 用 1 PBS 1ml 洗涤 1 次 离心 8 加入 PI 工作浓度 50ug ml 于 500ul 1 PBS 中
2、室温避光孵育 30min 9 混匀 过 300 目筛网 置流式管中 4 冰箱保存 待测 GFP PIGFP PI 染色操作步骤染色操作步骤 1 将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中 离心 1500rpm 5min 弃上清液 2 加入 PBS 1ml 离心洗涤 1 次 弃上清 3 加入 2ml 预冷 PFA PFA 的浓度根据细胞的特点进行调节 4 固定 30min 以下步骤同 PI 染色操作步骤的 4 9 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1 将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中 离心 1500rpm 5min 弃上清液 2 以冷 PBA 1ml 离心洗涤
3、弃上清液 3 加入用 PBA 稀释的荧光素标记的抗体 200ul 用微量移液器轻轻吹打混匀 4 或置冰上 孵育 30min 1h 4 离心弃上清液 5 加入冷 PBS1ml 离心洗涤 2 次 以除去未结合的多余抗体成分 6 向细胞中加入冷 PBS 500ul 吹打混匀 置流式管中 4 避光保存 待测 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1 2 同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3 用 PBA 稀释的第一抗体 200ul 对照管加入对应于一抗的正常实验动物 IgG 轻轻吹打 混匀 4 或置冰上孵育 1 5 2h 离心 弃上清 4 PBS 1ml 离心洗涤 1 次
4、以去除多余的未结合的特异性抗体 5 PBA 适当稀释的荧光素标记的第二抗体 200ul 吹打混匀 4 或置冰上孵育 30min 避 光 6 PBS 1ml 离心洗涤 2 次 7 将细胞重新悬浮于 500ulPBS 中 混匀 置流式管中 避光 4 冰箱保存 待测 胞内直接免疫荧光染色操作胞内直接免疫荧光染色操作步骤步骤 1 将单细胞悬液加入 2ml 圆底离心管中 离心 1500 rpm 5 min 弃上清液 2 用 1 PBS 1 ml 洗涤 1 次 离心 3 4 PFA 1ml 4 固定 30min 4 用 1 PBS 1ml 洗涤 1 次 离心 5 0 1 Triton 100 1ml 室温
5、 10min 6 用 1 PBS 1ml 洗涤 1 次 离心 7 加入用 PBA 稀释的荧光素标记的抗体 200ul 用微量移液器轻轻吹打混匀 4 或置冰上 孵育 30 min 1h 8 离心弃上清液 9 加入冷 PBS1ml 离心洗涤 2 次 以除去未结合的多余抗体成分 10 向细胞中加入冷 PBS 500ul 吹打混匀 置流式管中 4 避光保存 待测 胞胞内间接免疫荧光染色操作内间接免疫荧光染色操作步骤步骤 1 6 同胞内直接免疫荧光染色操作步骤 7 加入用 PBA 稀释的第一抗体 200 ul 对照管加入对应于一抗的正常实验动物 IgG 轻轻 吹打混匀 4 或置冰上孵育 1 5 2 h
6、离心 弃上清 8 冷 PBS 1ml 离心洗涤 1 次 以去除多余的未结合的特异性抗体 9 加入 PBA 适当稀释的荧光素标记的第二抗体 200 ul 吹打混匀 4 或置冰上孵育 30 min 避光 10 冷 PBA 1ml 离心洗涤 2 次 11 将细胞重新悬浮于 500 ul PBS 中 混匀 置流式管中 避光 4 冰箱保存 待测 备注 备注 1 RNase A 贮液浓度 1mg ml 工作液配制 加 1 mg ml 贮液 10ul 于 500ul 1 PBS 中 使终浓度为 20ug ml 2 PI 贮液浓度 2 5mg ml 工作液配制 加 2 5 mg ml 贮液 10ul 于 500ul 1 PBS 中 使终浓度为 50ug ml 3 PBA 即 PBS 加 1 2 牛血清白蛋白 加 0 1 叠氮钠 4 检测样品细胞浓度 1x10 6 ml
