《PD 肿瘤浸润性CD T淋巴细胞的分离与鉴定.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PD 肿瘤浸润性CD T淋巴细胞的分离与鉴定.doc（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、PD1+肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞的分离与鉴定李小红，陈陵，朱波 （400037 重庆，第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所 ）【摘要】目的 从肿瘤局部分离衰竭性CD8+T淋巴细胞（CD8+PD1+T cell），并对其功能进行研究。初步探讨机体免疫系统无法有效杀伤和清除肿瘤的原因。方法 C57BL/6小鼠皮下注射Lewis肺癌细胞株建立小鼠肿瘤模型。将肿瘤制成单细胞悬液后，染细胞表面标志。采用流式细胞术从肿瘤局部分选CD8+PD1+T淋巴细胞及CD8+PD1-T淋巴细胞，体外经非特异性刺激后行细胞内因子染色，检测IFN-分泌能力。CFSE细胞染色检测其增殖活性。结果 肿瘤局部成功分离得浸润性
2、CD8+T淋巴细胞，其中将近80%的细胞高表达衰竭表型PD1+。CFSE结果显示CD8+PD1+T cell较CD8+PD1-T cell增殖活性明显下降；细胞内因子染色后流式细胞术检测结果显示肿瘤局部CD8+PD1+T cell较CD8+PD1-T cell IFN-分泌能力降低约50%。结论 肿瘤局部存在一群免疫衰竭性T细胞，可能参与了肿瘤的免疫逃逸。【关键词】 肿瘤；T 淋巴细胞；PD1【中图法分类号】 R392.12；R73-35+4；R730.3Identification of tumor-infiltrating CD8+PD1+T-lymphocytes in Lewis lu
3、ng cancerLi Xiaohong；Chen Ling；Zhu Bo （Cancer Center of PLA, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China）Abstract Objective To identify the biological function of tumor-infiltrating CD8+ PD1+T-lymphocytes in Lewis lung cancer. Methods The implanted tumor model was e
4、stablished by injection of Lewis lung carcinoma cells in C57BL/6 mice subcutaneously. CD8+PD1+T-lymphocytes and CD8+PD1-T-lymphocytes were isolated from transplanted tumors by flow cytometry and labeled with CFSE to follow their proliferation. The IFN- level of isolated cells was analyzed by intrace
5、llular cytokine staining. Results CD8+T-lymphocytes existed in the transplanted tumors. Some of those CD8+T-lymphocytes also expressed PD-1 which has been identified as a marker of exhausted T cells. In comparison with CD8+PD1-T-lymphocytes, the proliferation rate of CD8+PD1+T-lymphocytes was signif
6、icantly decreased and IFN- secretion was suppressed. Conclusion The tumor-infiltrating CD8+T-lymphocytes that express PD-1 do not have a normal function, which may be the reason that TIL can not kill tumor cells effectively.Key words Tumor；T lymphocyte；PD-1Corresponding author: Zhu Bo, E-mail: oncol
7、ogy_肿瘤现已成为发达国家的首要致死因素，发展中国家的次要致死因素。机体T细胞免疫在控制肿瘤的发生发展过程中起到了重要作用1-4。其中肿瘤局部浸润性CD8+ T淋巴细胞在机体抗肿瘤免疫应答中发挥了关键作用。近年来发现，肿瘤患者体内存在免疫抑制机制5，妨碍机体对肿瘤的清除，导致肿瘤长期定植，表现为T淋巴细胞功能障碍与增殖能力减弱6。PD1已被公认为是衰竭性T淋巴细胞的表面标志7。阻断PD1-PD1L通路可以部分恢复衰竭性T细胞的功能8-10。为确认肿瘤局部是否存在衰竭性T淋巴细胞，并进一步研究其功能特点，揭示肿瘤在体内长期定植的原因。本课题组通过小鼠皮下注射Lewis肺癌细胞株，建立了小鼠肿瘤
8、模型。从肿瘤局部分离得到CD8+PD1+T cell，并对细胞自身特点与功能做了初步探讨。1 材料与方法1.1 细胞培养Lewis肺癌细胞株（购自中国科学院上海细胞库）DMEM(High Glucose)培养基（含10%胎牛血清）培养3-4d，胰酶（购自Hyclone）消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5107/mL。1.2 建小鼠肿瘤模型C57BL/6小鼠，SPF级，雌性，68周龄， 体重(222)g，购自重庆医科大学实验动物中心。所有动物实验经第三军医大学实验动物管理及伦理委员会审核通过。实验分实验组和对照组，每组5只小鼠。实验组小鼠双上肢腋下注射Lewis肺癌细胞，2107细胞/只。对
9、照组以培养基代替。同样方法注射。1.3 TIL(肿瘤浸润性T淋巴细胞)的制备实验组小鼠注射肺癌细胞后3周，无菌条件下取Lewis肺癌移植瘤标本，除去黄色脂肪组织及血块置于含双抗的PBS中浸泡5分钟（使用含双抗的PBS目的是为了尽量保证无菌，避免污染），充分剪碎，研磨制成单细胞悬液，经小鼠淋巴细胞分离液密度梯度离心后收集白膜层， DMEM培养基重悬，置入250ml细胞培养瓶，37，5%C02培养箱贴壁3小时。收集未贴壁细胞，其中即含有肿瘤浸润性T淋巴细胞。1.4 流式抗体与细胞分选抗小鼠CD8抗体（APC），抗小鼠PD1抗体（PE），抗小鼠IFN-抗体（PE-CY7）及同型对照均购自BD公司。未
10、贴壁细胞经CD8-APC、PD1-PE抗体4 30min染色后，经BD FACSAria流式细胞仪分选得CD8+PD1+T cell和CD8+PD1-T cell。1.5 CFSECFSE染色参考Ben J C Quah染色方案进行11。CFSE终浓度为1M。CFSE染色后细胞铺与96孔平底板，5000cell/孔。CD3抗体5 g/ml，CD28抗体2 g/ml，mIL-2 10U/ml 37体外刺激0d，1d，3d，5d，7d后分别进行流式检测。设不染色空白对照孔。1.6 细胞内因子染色（ICS）CD8+PD1+ T cell和CD8+PD1- T cell体外经PMA（终浓度50 ng/
11、ml）、离子霉素（终浓度 1g/ml）刺激5h后采用标准程序染细胞内因子IFN-12。细胞内因子染色试剂盒购自BD公司。1.7 统计学分析使用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数标准差表示。组间差异方差齐采用单因素方差分析；方差不齐采用秩和检验。2、结果2.1 肿瘤局部浸润性CD8+T细胞分离与鉴定为确定肿瘤局部是否存在浸润性淋巴细胞，肿瘤局部分离得单个核细胞后染CD8+表型，发现确存在肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞（图1A），为进一步明确CD8+T细胞亚群，复染PD1，发现存在一CD8+T细胞亚群高表达衰竭性表型PD1（图1B）。 A：肿瘤局部单个核细胞，单染CD8；B：CD8
12、+ T细胞复染PD1图1 肿瘤局部CD8+ T细胞亚群分析2.2 CD8+PD1+T cell在不同组织中的分布为进一步明确衰竭性表型PD1是否仅表达于肿瘤浸润性CD8+T细胞表面，将荷瘤小鼠和正常小鼠脾脏研磨制成单细胞悬液，染色后流式分析。比较CD8+PD1+ T cell在不同组织部位分布。结果发现CD8+PD1+T cell主要存在于肿瘤局部，荷瘤小鼠脾脏中也有一定的分布，而在正常小鼠的脾脏中几乎不存在（图2）。 N-Spleen：正常小鼠脾脏，T-Spleen：荷瘤小鼠脾脏，Tumor：肿瘤局部。图2 不同组织CD8+PD1+T细胞比例分布（n5）2.3 CFSE检测细胞增殖情况。为确
13、认肿瘤浸润性CD8+PD1+T淋巴细胞的增殖活性是否已发生变化，流式分选CD8+PD1+T cell和CD8+PD1-T cell分别标记CFSE，同时设不染色空白对照。分别在0天，1天，3天，5天，7天进行流式检测。结果发现CD8+PD1+T细胞的增殖能力（图3B）较CD8+PD1-T细胞（图3A）明显下降。 A:CD8+PD1-T cell在0d、1d、3d、5d、7d分别检测。B:CD8+PD1+T cell在0d、1d、3d、5d、7d分别检测。图中灰色空白为未染CFSE（空白对照），灰色实心为0d细胞尚未增殖（阳性对照）。黑色空白为细胞在相应检测时间点的增殖状态。图3 CFSE法检测
14、肿瘤局部CD8+PD1+T cell和CD8+PD1-T cell的增殖2.4 检测CD8+PD1+和CD8+PD1-两群细胞IFN-分泌功能。分选后CD8+PD1+T cell和CD8+PD1-T cell，体外经PMA和离子毒素非特异性刺激5小时后，行细胞内因子染色，流式检测其IFN-的分泌功能。发现CD8+PD1+ T细胞IFN-分泌能力明显降低（图4A-B）。统计发现，荷瘤小鼠肿瘤局部CD8+PD1-T细胞IFN-分泌能力较CD8+PD1+ T细胞强，但与正常小鼠脾脏中CD8+T细胞相比IFN-分泌能力亦明显下降。（图4C） A：肿瘤局部 CD8+PD1-细胞刺激后检测IFN-。B：肿
15、瘤局部CD8+PD1+细胞刺激后检测IFN-。C：肿瘤局部CD8+PD1+、CD8+PD1-两群细胞与正常小鼠脾脏中CD8+PD1-T cell经同样刺激后IFN-分泌对比。N-Spleen CD8+ PD1-：正常小鼠脾脏中CD8+ PD1-细胞。Tumor CD8+PD1-：荷瘤小鼠肿瘤局部CD8+PD1-细胞。Tumor CD8+PD1+：荷瘤小鼠肿瘤局部CD8+ PD1+细胞。图4 CD8+PD1+和CD8+PD1-两群细胞功能应答分析3、讨论肿瘤严重危害人体健康，影响患者生活质量，已被列为头号致死性疾病。目前临床上主要采用手术及放化疗手段进行治疗，除良性肿瘤及部分早期恶性肿瘤可起到好
16、的治疗效果外，晚期尤其是已伴发转移的恶性肿瘤尚无有效的治疗手段。研究发现，肿瘤患者常伴有免疫功能低下，表现为对肿瘤抗原无应答，无法有效清除体内肿瘤细胞。究竟何种免疫细胞在抗肿瘤过程中起到了关键作用，而其功能在肿瘤患者体内是否已发生变化，及如何增强其抗肿瘤活性已成为肿瘤研究中关注的重点。研究表明机体抗肿瘤过程中，CD8+T细胞发挥了关键作用。在急性感染过程中，初始CD8+T细胞接受抗原刺激后，活化并大量扩增为效应T细胞，当抗原清除后，有一小部分效应T细胞分化成记忆性T细胞13-15。但是在慢性感染和肿瘤中，抗原特异性的CD8+T细胞由于受到抗原持久的刺激，不能有效分化成记忆性T细胞而逐步演变成功能紊乱的一群细胞9, 15，
