《分子生物学：基因突变2 研究生课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学：基因突变2 研究生课件（136页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Chapter11GeneMutation Section1BasicConceptofGeneMutation 任何因素引起基因组DNA分子一级结构的异常改变 并导致生物个体表型的改变 称为基因突变 genemutation 根据引起基因突变的原因 可将其分为自发突变 spontaneousmutation 和诱发突变 inducedmutation 根据发生基因突变的细胞的不同 可将其分为生殖细胞突变 germcellmutation 和体细胞突变 somaticmutation Section2ClassificationandCharacteristicsofGeneMutation
2、1 TypeofGeneMutation 主要根据DNA一级结构改变情况分类 可分为单点突变 singlepointmutation 和多点突变 multiplepointmutation 点突变的形式包括转换 transition 颠换 transversion 插入 insertion 缺失 deletion 等 1 1PointMutation 基因组DNA中插入了其他的DNA小片段 导致读码框改变或基因失活 1 2InsertionMutationofDNAFragment 基因组DNA中丢失了小片段DNA 导致读码框改变或基因失活 1 3DeletionMutationofDNAFr
3、agment DNA碱基改变后 形成相应的简并密码 其编码的多肽链氨基酸序列不发生改变 称为同义突变 2 ResultsofGeneMutation 2 1SynonymousMutation DNA碱基序列改变导致其编码的多肽链氨基酸序列改变 称为错义突变 错义突变后的编码产物仍然保留部分生物学活性 则称为渗漏突变 leakymutation 错义突变后的编码产物如能全部保留原有生物学活性 则称为中性突变 neutralmutation 2 2MissenceMutation DNA碱基序列改变而产生终止密码 导致多肽链非正常终止称为无义突变 2 3NonsenceMutation DNA碱
4、基序列改变导致读码框的位移 使翻译的蛋白质成为无生物学活性的分子称为移码突变 2 4Frame shiftMutation 基因突变后 再经二次突变 其生物学功能完全恢复 称为回复突变 reversemutation 基因经第二次突变后 产生的突变效应只是对第一次突变的补偿 则称为校正抑制突变 suppressionmutation 3 ReverseofMutationEffects SuppressionMutationofarcGenefromPhageP22 基因组DNA分子中各部位发生的突变的机率不同 突变频率明显高于其他部位的突变区被称为突变热点 许多突变热点源于甲基化修饰的碱基
5、特别是发生于CpG岛 4 MutationHotspots 对于二倍体生物 决定其表型的某种生物活性物质的合成仅由一对等位基因控制 5 RelationshipofAllelesMutationwithPhenotype 5 1SingleAlleles 野生型纯合子 野生表型 突变型纯合子 突变表型 在一个基因座位上存在两个及以上的等位基因 每一对等位基因均有一定程度的变异 但这种变异对其功能没有影响 只是产生不同的表型 如决定某种颜色的等位基因 5 2MultipleAlleles 在某一种群基因组的座位上 存在多种不同的等位基因 从而决定不同的遗传表型 称为等位基因的遗传多态性 如决定A
6、BO血型的等位基因 5 3AllelesPolymorphism 6 DynamicMutation 串联的三核苷酸重复拷贝数可随世代递增而出现累加效应的突变 称为动态突变 在多种神经变性疾病中都存在三核苷酸的不稳定扩展 其中以CAG重复扩展导致的疾病较多 CAG重复扩展序列在各自的编码基因中产生一段多聚谷氨酰胺链 RepeatExpansionMutation RepeatExpansionMutationofDystrophiaMyotonicaProteinKinaseGene Section3ResultsofGeneMutation 1 BiologicalEvolution 基因突
7、变是生物进化的源泉 通过基因突变 可对现存基因进行改造 也可产生新的基因 2 GeneticDiseases 对于高等生物来说 有利的基因突变是很少的 因此 基因突变的后果常常是引起人类的遗传性疾病 目前已知人类有8000多种疾病与基因突变有关 包括镰刀状红细胞贫血 苯丙酮酸尿症等 3 CellCanceration 与癌症发生直接相关的基因包括癌基因和抑癌基因 各种物理的 化学的或生物的诱变剂可使这些基因发生突变 从而引起细胞癌变 Section4Site directedMutagenesis 对已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基 在体外条件下人工诱发碱基的取代 插入或缺失变化的过
8、程称为基因的定点诱变技术 定点诱变技术是进行基因工程和蛋白质工程的重要手段 1 Site directedMutagenesisDirectedbyOligonucleotide 利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段 取代野生型基因中的相应序列 从而达到定点突变的目的 称为盒式诱变 实施盒式诱变时 要求靶DNA插入点两侧有合适的限制酶单一切点 1 1CassetteMutagenesis ProcessofCassetteMutagenesis AnExampleofCassetteMutagenesis 1 2DopedCassetteMutagenesis 粘性盒式诱变通常同时设计
9、并合成两套带突变碱基的寡核苷酸单链 然后在DNA聚合酶的催化下进行重叠延伸 用限制酶切断后 可获得两套双链的寡核苷酸片段 即可用于取代原有的目的基因片段 此法可提高基因诱变的效率 DopedCassetteMutagenesis 利用一段含有突变序列的寡核苷酸片段作为引物 经DNA复制过程合成靶DNA片段 使其子代链发生突变 称为引物诱变 1 3PrimerMutagenesis 引物诱变的基本操作步骤 获得单链目的基因 人工合成带突变序列的引物 制备异源双链DNA 转染宿主细胞 筛选重组体 突变基因的鉴定和回收 ProcessofPrimerMediatedMutagenesis 1 4Qu
10、ikChangePrimerMutagenesis 这是由Stratagene公司开发的一种引物定点诱变法 该法的操作步骤如下 将带目的基因的重组体在dam 菌株中扩增 使DNA序列被dam甲基化酶所修饰 使用带突变碱基的寡核苷酸引物 在较高温度下复制子代链 形成双链突变体 用限制酶Dpn 将带甲基化标记的亲代双链水解 将突变体转化宿主细胞 ProcessofQuikChangePrimerMutagenesis 1 5TheKunkelMutagenesisMethod 这是1985年由Kunkel等人建立的一种寡核苷酸引物诱变法 该法的操作步骤如下 将复制型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷三磷
11、酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的E coli dut ung 菌株中生长 使U取代T掺入到DNA链中 一般每个重组体20 30个 以此种带U的DNA链为模板 用带突变碱基的寡核苷酸引物进行复制 产生异源双链 将此异源双链转化到ung 尿嘧啶脱糖苷酶阳性 菌株中生长 含U的模板链被破坏 从而使子代DNA链大部分 80 含突变碱基序列 ProcessofTheKunkelMutagenesis 1 6PrimerMutagenesiswithRestrictionEnzymeSiteElimination 限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的
12、DNA片段的特性 去除不含突变碱基的亲代模板链 以提高定点突变效率的技术方法 限制酶位点消除法的操作步骤是 将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链模板退火后 加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复制 产生具有硫代磷酸核苷酸的异源双链DNA 用特定的限制酶在此异源双链DNA上作切口 此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸而被切开 而新合成的子代链则无法切割 使用核酸外切酶将亲代模板链全部水解去除 然后再以含硫代磷酸核苷酸的子代单链为模板 经二次复制合成双链 PrimerMutagenesiswithRE SiteElimination 2 Site directedMutagenesisbyPCR 将所使用
13、的引物之一进行定点碱基突变后 作第一轮PCR扩增 将第一轮扩增产物作为第二轮PCR扩增的引物来使用 从而使第二轮扩增的产物带突变的碱基 2 1 1MegaprimerExtensionPCRMutagenesis 2 1BaseSubstitutionMutagenesis MegaprimerExtensionPCRMutagenesis 2 1 2OverlapExtensionPCRMutagenesis 使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序列分别进行第一轮PCR扩增 将扩增产物进行重叠退火延伸 获得带突变碱基的完整序列 使用该完整序列的两端引物进行第二轮PCR扩增 OverlapE
14、xtensionPCRMutagenesis 2 2DeletionPCRMutagenesis 用于PCR扩增的引物中存在人为的DNA片段的缺失 这样就会在PCR扩增后的产物中引入此缺失 此法适用于在扩增DNA序列的末端制造缺失序列的情况 2 2 1DeletionMutagenesisUsingMismatchPrimer DeletionMutagenesisUsingMismatchPrimer 2 2 2DeletionMutagenesisbyPCRFusion 使用两套引物分别扩增欲缺失片段两侧的序列 此两套引物的5 端序列互补 利用两套扩增产物5 端的互补序列进行退火重叠并进行
15、第二轮PCR延伸 获得完整的突变体 DeletionMutagenesisbyPCRFusion 2 2 3DeletionMutagenesisbyInvertedPCR 将带目的基因的DNA重组体作为模板进行PCR扩增 所设计的一对引物与目的基因的两侧序列互补 不包括需缺失的序列 并向载体DNA方向进行扩增 扩增后的线性产物依靠两侧的互补序列重新退火并连接成环状的双链DNA DeletionMutagenesisbyInvertedPCR 2 3InsertionPCRMutagenesis 使用5 端带有与目的基因互补的一对引物来对欲插入的DNA片段进行PCR扩增 将扩增产物与单链的目的
16、基因重组体进行退火 延伸并连接 生成异源双链的重组体 转化宿主细胞以获得带有新插入序列的双链重组体 2 3 1InsertionMutagenesisbyPCRRecombination InsertionMutagenesisbyPCRRecombination 3 3 2InsertionMutagenesisbyPCROverlapExtension 设计并合成两套用于PCR扩增的引物 分别用于目的基因两侧半序列的扩增 但在这两套引物的5 端均添加了欲插入的互补序列 经PCR扩增后的产物 通过此互补序列进行重叠延伸 生成完整的双链DNA 即可将新的序列引入目的基因中 InsertionMutagenesisbyPCROverlapExtension 2 4ErrorProne Sloppy PCRMutagenesis 错误倾向PCR诱变是通过增加Mg2 和TaqDNA聚合酶的浓度 使PCR扩增过程中复制错配率增加而随机产生碱基突变 4 ApplicationofSite directedMutagenesis 研究基因的结构与功能之间的关系 研究DNA 蛋白质 蛋白质 蛋白质的
