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1、11.1 植物组织培养的理论基础（重点在概念）植物细胞工程的概念(Definition of plant cell engineering)：植物细胞工程是植物生物技术的一个重要组成部分，是在离体培养条件下，在细胞水平上对植物材料进行遗传操作的技术，即对植物体的任何一个部分（器官、组织、细胞、原生质体）进行离体诱导使其称为完整植株的技术。细胞全能性的一般概念：每个细胞都含有个体的全部遗传信息，都有分化成一个完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱: 营养生长中心 形成层 薄壁细胞 厚壁细胞(木质化细胞) 特化细胞(筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织
2、不同从强到弱为： 顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生组织 薄壁组织(基本组织) 厚角组织 输导组织 厚壁组织。所谓细胞分化，是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。分化细胞在一定条件下，可以转变为胚性状态，重新获得分裂能力，称为脱分化。外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。愈伤组织的种类:胚性愈伤组织 （Embryonenic callus）和非胚性愈伤组织：细胞的再分化（redifferentiation)是脱分化后的分生细胞（愈伤组
3、织）在一定条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株。由愈伤组织再分化形成再生植株，可经过器官发生和胚状体发生两条途径。通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式： 第一种方式是先芽后根； 第二种方式为先根后芽； 第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。一般认为，芽和茎原基通常起源于培养组织中比较表层的细胞，即外起源，而根原基则发生在组织较深处，是内起源。 影响器官分化的因素1.外植体- 位置、状态及组织类型2.生长调节剂3.光照4.温度培养细胞变异的类型1、自发产生的变异，2、诱发产生的变异，影响离体培养细胞遗传变异的因子1、供体植株 倍性水
4、平、基因型、外植体细胞的分化程度2、培养基及培养方式 培养基的成分、物理状态及培养类型原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养的变异，而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异3、继代培养的次数一般来讲，继代时间越长、继代次数越多，细胞变异的几率就越大。优良变异的筛选方法（1）直接筛选法(2)间接筛选法体细胞无性系变异的利用1创造育种中间材料或直接筛选新品种2遗传研究3发育生物学研究4生化代谢途径研究变异的抑制1、利用比较稳定的品种材料。 2、利用茎尖、幼胚等再生能力较强的组织进行培养。 3、 避开使用高浓度激素。 4、不经过愈伤组织，而直接从脱分化细胞再生。 5、尽量促使植株早再生，使培养时间缩短
5、。11.2植物组织培养（重点在无菌操作）简述植物离体培养中无菌操作过程。1、实验器具和材料的准备2、用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。3、关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。4、用7075的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。5、取流水冲洗（至少30min）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。6、打开培养瓶，瓶口在灯
6、焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。7、收拾台面。n 分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件n 比例高时产生芽,比例低时产生根11.2.4 种质保存超低温保存技术1、保存材料的选择 2、（冷冻前材料）预处理 （3、添加冷冻防护剂 ）4、冷冻处理（快速冷冻、慢速冷冻、预冷冻、干燥冷冻） 5、材料保存6、保存材料解冻（快速解冻、慢速解冻）7、保存材料复苏培养（再处理）11.2.5 细胞培养（重点在细胞培养方法、细胞同步化方法、植物细胞培养的特性及悬浮细胞系的建立）植物细胞培养（plant cell culture）是指在离体条件下对植物单个细胞
7、或小的细胞团进行培养使其增殖的技术由完整的植物器官分离单细胞，叶片是分离单细胞的最好材料。机械法、酶解法（用果胶酶）由培养组织分离单细胞：(1) 诱导产生愈伤组织；(2) 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性：（3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物细胞悬浮培养的概念： 悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，均一性好，细胞生长迅速。 悬浮细胞的同步化：细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期常用的处理方法：1、物理方法：1）分选法，通过细
8、胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。2）冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度2、化学方法：1）饥饿法，悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。2）抑制剂法，通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。3）有丝分裂阻抑，用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜。在进行同步化处理之
9、前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。细胞平板培养概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。 植板率()(形成的细胞团数/接种的细胞数)100看护培养概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。微室培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。特点：（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程（2）培养基少，营养和水分难以保持，p
10、H值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂饲养层培养基技术将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用。植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。植物次生代谢产物生产的理想途径是规模化细胞培养，优点是可以保护生态环境、提高生产效率和发展新型生物技术产业。 培养系统: 1、悬浮培养系统 2、固定化培养系统植物细胞规模培养技术关键 1、细胞系的建立与选择； 2、优良细胞系的增殖培养； 3、大规模培养体系的建立 植物
11、细胞培养的特性1植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；2培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；3细胞生长的中期及对数期易凝聚为直径达350JJm一400Pm的团块，悬浮培养较难；4培养时需供氧，培养液粘度大：5具有群体效应；6 因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；7细胞培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；8 悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（2500050000个/ML）。n 细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：n 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻
12、酸盐b、聚丙烯酰胺等；n 附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。三.植物细胞规模培养技术要点n 1.细胞系的建立和选择2.优良细胞系的增殖培养3.大规模培养体系的建立n 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。n 两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。n 如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。n 植物细胞生长与产物合成的关系生长偶联型 产
13、物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等； 中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型； 非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。 12 植物的快速繁殖（重点在概念、快繁体系的建立及脱毒的方法与原理）离体无性繁殖(propagation in vitro) ：利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传形状一致的个体的方法。也称之为微繁(micr
14、opropagation)、快速繁殖（rapid clone progagation）。植物脱毒（virus elimination）：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康的繁殖材料。体细胞胚或胚状体：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。繁殖系数（breeding coefficient）：也叫增殖率，指每块外植体在一个培养周期内增殖的倍数快速繁殖意义（1）繁殖速度快，经济效益高（2）占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗，（3）保持植物种性（4）繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。离体无性繁殖程序：（
15、1）无菌培养物建立（2）培养物的增殖（3）生根培养（4）炼苗和移栽（5）再生植株的鉴定无菌培养物的建立程序包括：外植体的选择外植体灭菌接种培养等基本过程。培养物的增殖：腋芽增殖；不定芽增殖；胚状体增殖; 愈伤组织增殖；原球茎增殖腋芽增殖其特点是：培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。这一繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。 不定芽增殖特点：繁殖系数高，遗传稳定性较好。但继代次数有限。培养物继代一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新建立起始无菌培养物。此外，不定芽需要进行生根培养才能形成真正的植株。 诱导不定芽一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素，其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免产生过多的愈伤组织
