第七章发酵工艺控制ppt课件

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1、 第七章发酵工艺控制 温度 pH 氧气 二氧化碳 泡沫发酵染菌的防治与处理发酵终点的判断等 发酵是一种很复杂的生产过程 其好坏涉及诸多因素 如菌种的生产性能 培养基的配比 原料质量 灭菌条件 种子质量 发酵条件和过程控制等 不论是老或新品种 都必须经过发酵研究这一阶段 以考察其代谢规律 影响产物合成的因素 优化发酵工艺条件 高产菌种对工艺条件的波动比低产菌种更敏感 故掌握生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对生产的稳定和提高具有重要的意义 一 发酵过程的操作类型 1 分批发酵2 补料分批发酵3 连续发酵 1 分批发酵 是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后 接入少量的微生物菌种进行培养

2、 使微生物生长繁殖 在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法 一次投料 一次接种 一次收获间歇培养 分批发酵过程一般可粗分为四期 即适应 停滞 期 对数生长期 生长稳定期和死亡期 也可细分为六期 即停滞期 加速期 对数期 减速期 静止期和死亡期 一 初级代谢的代谢变化 初级代谢是生命细胞在生命活动过程中所进行的代谢活动 其产物为初级代谢产物 菌体的生长过程显示生长史的特征 但在发酵过程中 即使是同一种菌体 由于菌体的生理状态和培养条件的不同 各期的生长长短就有所不同 生产中要求在对数期接种原因就在此 初级代谢没有明显的产物形成期 产物随着菌体生长在不断的进行合成 有的与菌体的生长呈平行

3、关系 如乳酸 醋酸几乎在同一时期出现 而氨基酸 酶 核酸的发酵过程比前者复杂 随培养基成分 碳源 温度 菌株等不同而变化 二 次级代谢产物变化 次级代谢产物包括大多数的抗生素 生物碱和微生物毒素等物质 它们的发酵属于生长与产物非偶联的类型 一般分为菌体生长 产物合成和菌体自溶 个阶段 菌体生长阶段 接种后 菌体开始生长 直达到菌体的临界浓度 同时 营养物质进行分解代谢 不断的消耗 浓度明显减少 溶氧浓度逐渐降低到一定的水平 其中某一参数可能成为菌体生长的限制因素 使菌体生长速度减慢 积累了相当量的某些代谢中间体 原有的酶活力下降 出现了与次级代谢有关的酶 其酶解除了控制等原因 导致菌体的生理状

4、况发生改变 菌体就从生长阶段转入产物合成阶段 这一阶段又称为菌体的生长期或发酵前期 产物合成阶段 产物数量逐渐增多 直至达到高峰 生产速率也达到最大 直至产物合成能力衰减 此阶段 营养物质不断被消耗 产物不断被合成 环境因素很重要 发酵条件应严格控制 方有利于产物合成 营养物质过多 菌体就进行生长繁殖 抑制产物合成 使产物量降低 如果过少 菌体就衰老 产物合成能力就下降 产量减少 这一阶段又称为产物分泌期或发酵中期 菌体自溶阶段 菌体衰老 细胞开始自溶 氨氮含量增加 p 上升 产物合成能力衰退 生产速率下降 此时应必须结束发酵 否则 影响产品的提取 这一阶段又称为菌体的自溶期或发酵后期 分批发

5、酵的优缺点 操作简单 周期短 染菌的机会减少 生产过程 产品质量易掌握 对基质浓度敏感的产物 用分批发酵不合适 2 补料分批发酵 一种介于分批培养和连续培养之间的操作方式 在进行分批培养的过程中 向反应器内加入培养基的一种或多种成分 以达到延长生产期和控制培养过程的目的 没有输出或间歇放掉部分发酵液 半连续发酵 补料分批发酵与传统分批发酵相比 优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度 低基质浓度的优点 1 可解除底物抑制 产物的反馈抑制和快速利用碳源的阻遏效应 并维持适当的菌体浓度 使不致于加剧供氧的矛盾 2 可降低培养基的黏度 并尽可能地延长产物的形成时间 3 避免培养基积累有毒代谢物 与连续

6、发酵相比 补料分批发酵不需要严格的无菌条件 也不会产生菌种老化和变异等问题 2 连续发酵 连续培养或连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基 同时以相同的速度流出培养液 使培养系统内培养液的液量维持恒定的微生物培养方式 连续发酵的优缺点 1 可提高设备利用率和单位时间的产量 节省发酵罐的非生产时间 2 便于自动控制 3 增加了染菌机会 长时间不断地向发酵系统供给无菌空气和培养基 4 菌种发生变异的可能性较大 二 发酵条件的影响及其控制 微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件的控制 了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌的生理代谢和发酵过程变化的规律 可以帮助人们有效地

7、控制微生物的生长和生产 常规的发酵条件 罐温 搅拌转速 搅拌功率 空气流量 罐压 液位 补料 加糖 油或前体 通氨速率以及补水等 表征过程性质的状态参数 pH 溶氧 DO 溶解CO2 氧化还原电位 尾气O2和CO2含量 基质或产物浓度 代谢中间物或前体浓度 菌浓等 间接状态参数 比生长速率 摄氧率 释放速率 CER 呼吸商 RQ 基质消耗速率和产物合成速率等 在分批发酵中 当基质过量时 菌体的生长速率与营养成分的浓度无关 菌体的生长比速Ks 半饱和常数S 限制性基质浓度 max 最大比生长速度在S ks的情况下 比生长速率与基质浓度呈线性关系 1 基质浓度对发酵的影响 在S 10ks时 比生长

8、速率就接近最大值 所以营养物质均存在一个上限浓度 在此浓度以内 菌体的比生长速率随浓度增加而增加 但超过此限 浓度继续增加 反而会引起生长速率下降 这种效应称基质的抑制作用 在正常的情况下 可达到最大比生长速率 然而 由于代谢产物及其基质过浓 而导致抑制作用 出现比生长速率下降的趋势 e g G 100 150g l 不出现抑制G 350 500g l 多数微生物不能生长 细胞脱水 就产物的形成来说 培养基过于丰富 有时会使菌体生长过旺 黏度增大 传质差 菌体不得不花费较多的能量来维持其生存环境 即用于非生产的能量大大增加 这对产物合成不利 1 碳源的种类和浓度的影响和控制碳源分为迅速利用的碳

9、源和缓慢利用的碳源 迅速利用的碳源能较迅速地参与代谢 合成菌体和产生能量 并分解产物 如丙酮酸 有利于菌体的生长 但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用 慢速利用的碳源为菌体缓慢利用 有利于延长代谢产物的合成 如抗生素 许多药物发酵采用 例如乳糖 蔗糖 麦芽糖 玉米油分别是青霉素 头孢菌素C 盐霉素 核黄素及生物碱发酵的最适碳源 因此选择最适碳源对提高代谢产物产量是很重要的 在工业上 发酵培养基中常采用迅速和缓慢利用的混合碳源 来控制菌体的生长和产物的合成 碳源的浓度也对发酵有影响 由于过于丰富所引起的菌体异常繁殖 对菌体的代谢和产物合成和氧的传递会产生不良影响 若产生阻遏作用的碳源用

10、量过大 则产物的合成会受到明显的抑制 控制碳源的浓度 可采用经验法和动力学法 即在发酵过程中采用中间补科的方法来控制 2 氮源的种类和浓度的影响和控制氮源象碳源一样 也有迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源 迅速利用的氮源有 氨基态氮的氨基酸 硫酸铵 玉米浆 慢速利用的氮源有 黄豆饼粉 花生饼粉 棉籽饼粉等蛋白质 快速利用氮源容易被菌体所利用 促进菌体生长 但对某些代谢产物的合成 特别是某些抗生素的合成产生调节作用 影响产量 如链霉菌的竹桃霉素发酵中 采用促进菌体生长的铵盐 能刺激菌丝生长 但抗生素产量下降 缓慢利用的氮源对延长次级代谢产物的分泌期 提高产物的产量是有好处的 但一次投入 也容易促进菌

11、体生长和养分过早耗尽 以致菌体过早衰老而自溶 从而缩短产物的分泌期 发酵培养基一般是选用含有快速和慢速利用的混合氮源 如氨基酸发酵用铵盐和麸皮水解液 玉米浆 链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉 但也有使用单一的铵盐或有机氮源 如黄豆饼粉 为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶 在发酵过程中 补加氮源来控制浓度 3 磷酸盐浓度的影响和控制 磷是微生物生长繁殖所必需的成分 也是合成代谢产物所必需的 微生物生长良好所允许的磷酸盐浓度为0 32 300mmol 但对次级代谢产物合成良好所允许的最高平均浓度仅为1 0mmol 提高到10mmol 就明显影响其合成 磷酸盐浓度在初级代谢中的要求不如次级代谢严格 对

12、抗生素来说 常常是采用生长亚适量磷酸盐浓度 其最适浓度取决于菌种特征 培养条件 培养基的组成和来源等因素 2 灭菌情况 随着灭菌温度的升高和灭菌时间的延长 养分的破坏越大 例如葡萄糖氧化酶活性会随着温度的升高和灭菌时间的延长而下降 3 种子质量 接种菌龄 一般为对数生长期后期接种量 一般为5 10 接种量大小是由菌的生长繁殖速度决定的 种子多 占优势 防止杂菌污染 但过多会使黏度增加 溶氧不足 影响产物合成 4 温度对发酵的影响和及其控制 微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的 温度是保证酶活性的重要条件 因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境 1 温度对微生物生长的影响 大多

13、数微生物在20 40 的温度范围内生长 嗜冷菌在温度低于20 下生长速率最大 嗜中温菌在30 35 左右生长 嗜热菌在50 以上生长 2 温度对发酵过程的影响 温度对青霉菌生长速率 呼吸强度和青霉素生产速率的影响如上图所示 可以看出 温度对参与生长繁殖 呼吸和青霉素形成的各种酶的影响是不同的 青霉菌 生长E 34kJ mol呼吸E 71kJ mol产物合成E 112kJ mol青霉素形成速率对温度最为敏感 偏离最适温度引起的生产率下降比其他两个参数的变化更为严重 活化能E反映温度变化对酶反应速率的影响 3 温度对发酵液物理性质的影响 影响氧在发酵液中的溶解度温度溶氧 影响基质的分解速率如菌体对

14、硫酸盐吸收在25 时最小 4 温度对生物合成方向的影响 金色链丝菌 研究发现 温度与微生物的调节机制关系密切 例如 在20 时 氨基酸末端产物对其合成途径的第一个酶的反馈抑制作用 比在其正常生长温度37 时更大 因此 考虑在抗生素发酵的后期降低温度 加强氨基酸的反馈抑制作用 使蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早些 从而使发酵代谢转向抗生素的合成 5 影响发酵温度的因素 发酵热 发酵热指的是发酵过程中释放出来的净热量 以J m3 h 为单位表示 生物热 生产菌在生长繁殖过程中产生的热叫生物热 营养基质被菌体分解产生大量的热能 部分用于合成高能化合物ATP 供给合成代谢所需要的能量 多余的热量则以

15、热能的形式释放出来 形成生物热 搅拌热 搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热能 蒸发热 空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后 进行热交换 必然引起水分的蒸发 被空气和蒸发水分带走的热量 Q蒸发 G I出 I进 辐射热 由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热能通过罐体向大气辐射的热量 显热 废气因温度差异所带走的热量 发酵热在整个发酵过程中是随时间变化的 所以 为使发酵在一定温度下进行 必须采取措施 在夹套或蛇管内通入冷水加以控制 小型的发酵罐 在冬季和发酵初期 散热量大于产热量则需用热水保温 6 最适温度的选择 所谓最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的合成 对

16、不同的菌种 不同的培养条件 不同的酶反应以及不同的生长阶段 最适温度有所不同 最适生长温度与最适生产温度往往是不一致的 如乳酸发酵 乳链球菌最适生长温度是34 C 而产酸最多的温度是30 C 但发酵速度最高的温度达40 C 青霉素产生菌的最适生长温度为30 但产生青霉素的最适温度是24 7 应根据发酵的不同时期 选择不同的培养温度 生长阶段选最适生长温度 在产物分泌阶段选最适生产生产温度 即变温控制 e g青霉素变温发酵 起初5小时 维持在30 C 以后降到25 C培养5小时 再降到到20 C培养28小时 最后又提高到25 C 培养40小时 放罐 青霉素的产量比在25 C恒温发酵条件下提高14 7 在不同的发酵阶段选择不同的温度 考虑培养基成分和浓度 例如 在使用较稀薄或较易利用的培养基时 提高温度则养分往往过早耗竭 导致菌丝过早自溶 产量降低 参考其它发酵条件 例如 通气条件较差的情况下 可以适当降低温度 一方面增加溶解氧浓度 另一方面降低菌体的生长速率 以弥补因通气不足而造成的代谢异常 发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标 是一项重要的发酵参数 它对菌