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1、Drosophila S2 cell culture protocols陈文锋一、基本注意事项（一）无菌操作培养所需一切物品、液体应无菌。操作前先列出所需物品，培养液须室温平衡，所有物品准备好后再操作，避免往复拿取用品。有关数据的计算要事先做好。（二）操作区消毒进入细胞室内换穿里面的拖鞋。无菌培养室每周用0.2%的新洁而灭（苯扎溴铵）拖地面1次（拖布专用），紫外照射15-30min。超净工作台使用前后需用75%乙醇擦洗，然后进行紫外灯照射1530min进行消毒，操作时打开风机。紫外照射期间不能放置培养细胞和培养液等。所有进入操作区域的物品需经75%乙醇擦拭消毒。工作台面均需经75%乙醇擦拭消毒
2、，特别是液体溢出时，需立即擦拭。移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%乙醇擦洗后置于台内同时紫外照射消毒。废液缸、污物盒每次做完实验马上清理倒掉。（三）洗手和着装乳胶手套75%乙醇喷洒消毒。白大褂定期高温高压灭菌。（四）火焰消毒培养或其他无菌操作时，首先点燃酒精灯。安装管帽、打开或封闭瓶口等，都需要在火焰近处。二、细胞培养条件S2细胞培养在Schneiders Drosophila Medium + 10% FBS的培养基中+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素，25无需要CO2培养。五、FBS分装及灭活分装：初次买500ml血清，4完全融化（过夜差不多20h，时间比较长），期间间隔
3、混匀。无菌操作分装于50ml离心管（直接倒，但是注意不要让血清瓶和离心管接触）。同时分装几管15ml的（15ml不好倒就用枪或移液管操作）。（-80保存）再次分装：等15ml的分装血清用完。把50ml的血清取出，4完全融化，期间间隔混匀。无菌操作分装于15ml离心管。灭活：把装有灭菌水的烧杯置于56水浴锅中，等水浴锅温度恒定，把装有血清的15ml离心管放于烧杯中，水位应超过血清的位置。灭活30 min，每隔10min混匀一次。六、枪头、枪消毒枪头：细胞用1ml枪头为加长的枪头（放于507柜子上），细胞室有三个盒子可以装此枪头。其余型号枪头为普通枪头。装枪头时戴上手套尽量在507超净台操作，灭菌
4、时一定用报纸包上。灭完烘干放回细胞室备用。枪：可高温高压灭菌。定期灭菌时包上锡箔纸高温高压灭菌后烘干。七、培养基配制Schneiders/ 10% FBS/PS（抗生素可以不加）表1 不同体积的完全培养配置Schneider medium225ml450ml45mlFBS25ml50ml5ml青霉素125ul（20万单位/ml=200U/ul）250ul25ul链霉素125ul（0.2g/ml）250ul25ul青霉素链霉素每瓶加4ml每瓶加5ml分装300ul/管分装300ul/管1、450ml Schneiders 培养基 （Sigma or Gibco 11720-034 or Lonz
5、a 04-351Q）2、加入50 ml FBS（热灭活过）。3、5ml 1：100青霉素和链霉素。-20保存。（最终浓度为青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml。一般市售青霉素为80万单位/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中（20万单位/ml），每升培养基中加入0.5ml；市售链霉素为1克/瓶，将其溶解于5ml中（0.2g/ml），每升加入0.5ml）。接mini-Q水，过滤膜，然后溶解抗生素。4、0.2u过滤后4保存。八、培养箱设置培养箱中放置水盘保持一定湿度：水盘中用去离子水或灭菌蒸馏水配置2%的硫酸铜。水盘定期更换，保证水不会全部挥发干。九、消毒液配置75%乙醇配置（手、超净台台面消毒）
6、：210毫升的纯净水790毫升的95%乙醇1升75%乙醇溶液。0.2%新洁尔灭配置（地板、台面等消毒）：500ml新洁尔灭+7000ml蒸馏水250ml新洁尔灭+3500ml蒸馏水100ml新洁尔灭+1400ml蒸馏水50ml新洁尔灭+700ml蒸馏水十、解冻细胞（细胞复苏）每个冻存管大约有1ml细胞悬浮液（大约2107个/ml）。解冻细胞程序：1、把冰箱中的培养基提前15-30min恢复至室温。吸取5ml完全培养基于T-25培养瓶。（DGRC有推荐培养基用量，见附件1）注：用60mm培养皿+4ml培养液也行，但是对于长得慢的细胞不推荐，因为培养皿容易挥发水蒸气。2、用枪头吸取一定量培养液于冻
7、存管，吹打混匀细胞。把细胞吸取到培养瓶或培养皿。注：不推荐用水浴的方法解冻细胞。把培养瓶放于培养箱中1-2 h。3、倒置显微镜下观察细胞状况。通常，大多数细胞在这个时候松弛地贴壁。如果是这样，轻轻地移除上清，换新的培养基。这步的目的是移掉DMSO（对细胞有毒）。把培养瓶放回培养箱过夜，第二天重复前步操作。注：S2细胞对DMSO不敏感，但是换培养液可移除冻过不好的细胞。注：如果1-2h之后看细胞还是悬浮，用离心的方法移除掉漂浮的细胞：把细胞液从培养瓶吸到离心管。加新的培养基到培养瓶子。离心细胞液除去上清。用来自培养瓶中的1ml培养基重悬沉淀（可能看不到）。把重悬浮的液体吸回培养瓶。4、有些细胞可
8、能要很长的时间才能开始长。如果2周细胞还不能transferred，吸掉一半培养基，加入新的。如果必要，重复此操作。十一、别人馈赠的细胞（培养瓶）把培养瓶放平，让细胞沉到底部。倒置显微镜观察细胞密度。如果1瓶底部已经长满一层细胞：轻轻悬浮细胞，然后把细胞悬浮液换到新的培养瓶或板，原始的培养瓶留下5ml培养基。把它们放入培养箱生长。如果2没有足够的细胞覆盖住培养瓶底部：吸掉大部分培养基，留下5ml。放入培养箱生长。细胞长到合适的时候就可以冻存。通常，果蝇细胞生长范围106-107个/ml。在107个/ml的时候，细胞完全覆盖住培养瓶或皿底部。100mm培养皿 10ml培养基60mm 培养皿 4m
9、l培养基25cm 培养瓶 5ml培养基6-well 2ml12-well 1ml24-well 0.5ml十二、细胞传代1、在细胞培养通风橱中，用灭菌过的枪头吸掉旧培养液体；（弃掉旧液，加入新液，再分瓶培养。）2、吸掉培养液体，加入新的培养液，直接用吸管将细胞吹打下来接种到新的培养瓶。也可以不弃掉旧培养液，直接用旧的培养液将细胞分配到新的培养瓶中，再补加新的培养液（我做过发现效果不好）。注：用吸管吹打细胞时，应避免起泡，且不要刮培养瓶。3、按一定比例将细胞悬浮液接种在含有新的细胞培养液的培养皿中，放入细胞培养箱中继续培养。（一般接种成浓度5x105个/ml）十三、细胞计数我们用的血球计数为25
10、中方格子的，共有两边计数室。每次两边计数室各挑取5个中方格进行计数。1、把计数板取出，盖上盖玻片。2、把要计数的细胞在1.5ml离心管中用灭菌水稀释，充分混匀。3、用枪吸取20-30ul稀释液体，用虹吸的原理让稀释液进入到细胞计数室。4、在荧光显微镜白光（10X）下找到视野。5、计算两边计数室各5个中方格细胞数。记为C1和C2。细胞浓度=稀释倍数（个/ml）十四、冻存生长到合适状态的细胞材料：Schneider medium 35ml +FBS 10ml + DMSO 5ml（放于细胞室柜子上）（4保存）冷藏的培养基：培养基+20%FBS+10%DMSO。无菌过滤(要制备滤膜除菌的DMSO溶液
11、，推荐使用teflon或nylon膜)，我们没有过滤，直接使用；4保存。冻存管（康宁公司）棉花和牛皮纸Produce:1、细胞生长到大约5106个/ml（mid-exponential growth）。2、收集细胞液离心，去上清。室温800-1000rpm，离心5min。3、用冷藏的培养基重悬，0.25原始体积（4ml*0.25=1ml or 5ml*0.25=1.25ml）。得到约2107个/ml的细胞。4、用吸管反复吹打细胞均匀。5、分装上清到冻存管子，0.5ml或1ml每管。6、封口膜封上管口，包上棉花，包上牛皮纸，绑上带子。7、放入-80过夜或2-3天。（-80保存我们试过至少可以保存
12、半年）8、转移到液氮长期保存。附件1：不同培养瓶需要培养液量BG-2c培养基配方：10mg/ml insulin 母液配制：准备0.01N HCL：2.59ul Hcl+3ml ddH2O=0.01N Hcl（Xml*11.6N）/3ml=0.01N把insulin分到1.5ml离心管，通过减法算出insulin质量mg，每10mg加1ml的0.01N Hcl，溶解insulin，配成10mg/ml, 分装200ul 10mg/ml母液。母液加入1.8ml（800ul-20ug/ml）SDM配成1mg/ml的，用滤膜（0.22um的膜过滤）再分装500ul/管，-20保存。培养基配制（50ml）：Insulin500ul（10ug/ml）(20 ug/ml)SDM 45mlFBS 5ml冻存液（10ml）Insulin 500ul（10ug/ml）SDM 7mlFBS 2ml（20%）DMSO （10%）
